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實驗設計對于轉錄組數據的分析是非常重要的，對于常規的case/control實驗設計，通過兩組間的差異檢驗就可以得到不同條件下的差異基因；對于多組的實驗設計，可以每兩組之間進行差異分析，也可以通過annova的檢驗，得到差異基因。
在多組的實驗設計中，有一種類型非常特殊，就是時間序列。這里的時間序列不僅僅指的是單純的不同時間點取樣，也包括生成發育的不同階段，疾病治療的不同階段等。生命活動是一個動態變化的過程，通過時間序列的實驗設計可以有效的挖掘基因的表達規律。
對于時間序列的實驗而言，通常會有多個時間點的設計，當然我們也可以兩兩之間進行差異分析，或者所有時間點進行方差分析，但是這樣得到的差異基因并不能有效的代表整個時間序列中的變化，而且兩兩分析會得到很多的差異基因列表，也增加了后續生物學規律的挖掘的難度。
為了有效利用時間序列的信息，科學家們提出了一種新的分析策略，就是基因表達模式聚類。所謂的表達模式，其實就是基因表達量隨著時間點變化的一個規律，比如對于一個疾病的臨床治療而言，選擇患病，藥物治療，治愈后3個時間段分析，我們希望看到藥物治療對疾病是有效的，與此相關的表達模式包括以下兩種
這種先上調后下調的變化規律就是一個特定的表達模式，符合某種特定模式的基因可能是參與相同的代謝通路，也可能是受到了相同分子的調控。對于特定表達模式下的基因進行GO, KEGG等功能富集分析，有助于挖掘潛在規律。
不同于傳統的差異分析，基因表達模式聚類分析中更關鍵的是篩選感興趣的表達模式，即表達量的變化規律，然后對給模式下的基因進行后續的功能富集分析。
能夠進行基因表達模式聚類分析的軟件有很多，STEM自帶圖形界面，操作簡單，是使用的較為廣泛的軟件之一，官網如下
http://www.cs.cmu.edu/~jernst/stem/
該軟件適用于處理時間節點較少的數據，比如8個或者更少，因為時間點越多，計算量越大，計算時間會特別長，占用的硬件資源也會更多。同時該軟件集成了Gene Ontology數據庫，可以方便的對特定表達模式下的基因進行GO富集分析。
該軟件的安裝非常簡單，下載安裝包，雙擊jar文件即可啟動。界面如下
界面分為4個部分，第一部分為Expression Data Info, 用于加載基因的表達量數據，第二部分為Gene Info, 用于加載基因對應的注釋信息，第三部分為Options, 用于設置聚類的算法和參數，第四部分為Execute, 用于執行程序。
1. Expression Daa Info
該軟件支持讀取芯片和NGS兩種數據，通過Data File加載表達量文件，表達量文件的格式如下
第一列為SPOT, 代表探針ID, 每個探針ID必須是唯一的，對于NGS數據，可以不要這一列信息；第二列為Gene Symbol, 如果沒有gene symbol信息，對應的單元格為空或者用0填充，其他列為每個時間點對應的表達量，時間點按照順序排列，表達量允許為空。
如果每個時間點有生物學重復的話，可以通過Repeat Data加載生物學重復的表達量文件，格式和上述格式完全一樣，要注意的一點就是行列必須和Data File文件中一致，這意味著每個時間點的生物學重復個數必須一致。
在芯片中會出現多個探針對應同一個基因的情況，該軟件會將同一個基因的多個探針的表達量取中位數，作為該基因的表達量；對于生物學重復，也是取中位數作為最終的表達量。
對于生物學重復個數不同的情況，可以自己先合并生物學重復，即選取中位數作為表達量，然后在進行分析。
上傳成功后，通過View Data File按鈕進行查看，示意如下
在進行聚類前，該軟件首先會對原始的表達量進行轉化，有以下3種策略
Log normalize data
Normalize data
-
No normalization/add 0
具體的轉換規則如下
將第一個時間點作為control, 將其表達量定義為0， 其他的時間點依次與第一個時間點原本的表達量進行比較。通常我們選擇log轉換的方法。
從這里可以看出，STEM并不會對輸入的原始數據進行樣本間的歸一化，所以我們的輸入數據必須是可以直接在樣本間比較的表達量，對于raw count的定量方式而言，需要輸入歸一化之后的表達量。
2. Gene ?Info
STEM支持自定義基因注釋，格式如下
第一列為基因或者探針ID，第二列為對應的注釋，多個注釋用分號:，逗號，或者 | 分隔。
3. Options
STEM支持以下兩種聚類方法：
STEM
-
K-means
默認選擇STEM聚類算法，該算法需要調整以下兩個參數
每一個特定的表達模式稱之為model profile, STEM通過第二個參數控制兩個時間點間基因變化趨勢的類別，這個參數可以看做差異的倍數，默認值為2，示意圖如下
對于兩個連續的時間點而言，STEM在判斷變化趨勢時不是簡單的上調和下調兩種，而是根據差異的倍數進行了細分，在上圖中，根據差異的倍數可以劃分出5個趨勢，第一個為上調倍數2倍以上，第二個為上調倍數在1倍到2倍之間，第三個為差異倍數在1倍以內，第四個為下調倍數在1倍到2倍之間，第五個為下調倍數在2倍以上。
用C代表上面的倍數值，用n代表時間點的個數，則所有可能的profile的個數為
當時間點較多時，所有的profiile太多了，根本看不過來，所以需要對其過濾，最終挑選出多少個profile 則有第一個參數控制。STEM根據profile之間的距離，從所有的profile中挑選出距離最大的N個profile, 任意兩個profile間的距離都很大，意味著它們是完全不同的profile。
在profile中，有一部分是由于生物學規律的影響而出現的特定表達模式，有一部分是隨機出現的，為了剔除這部分隨機性的profike, 通過特定的統計模型計算每個profile的p值，p值小于0.001的認為是真實的, 有研究價值的profile。
運行完成后，會產生如下的結果
每個profile對應一個矩形，在矩形左上角的數字為profile的編號，從0開始，其中的折線為表達量隨時間變化的趨勢，有顏色標記的是p值小于0.001的profile。
每個profile都是可以點擊的，點擊之后可以看到該profile下所有基因的變化趨勢圖
Profile Gene Table可以看到該profiel下具體的基因列表和轉換后的表達量，示意如下
這個列表可以導出，對于感興趣的profile, 可以導出該profile下的基因，去做pathway等富集分析。
以上就是該軟件的基本用法，更加詳細的用法請參考官方文檔。
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