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近日，兩個卵子結合產生后代的研究一經發表，立即引起熱議，很多男性開始擔心自己的“生殖地位”會下降。事實上，男性的半邊天在一連串打擊下飽受壓力：Y染色體的消失、克隆動物的出現以及兩個卵子可產生后代。雄性動物會被“忽略”嗎？
文｜葉水送
兩個卵子的結合，居然成功產出健康的幼鼠，整個過程無需雄性參與。這一顛覆了人們對生殖認識的研究成果，11月17日發表在科學期刊Cell Rsearch上，引發媒體持續地關注。
這項研究是上海生化與細胞研究所研究員李勁松在單倍體細胞系研究領域的又一次突破。很多人擔心這一技術會使用在人類身上。對此，李勁松表示，“強烈反對利用這種技術來制造人類后代”。
- 令人著迷的單倍體細胞系 -
單倍體細胞系研究一直讓各國科學家著迷。這是因為通過單倍體細胞克隆的個體是研究者研究生命奧秘的理想模型，研究者可針對單倍體細胞進行基因編輯。由此產生的表型直接體現在幼鼠身上，極大地提高了基因編輯的效率。
李勁松對這一領域的興趣并非一時興起，當年還在洛克菲勒大學做博后的他，面臨著抉擇：回國后是繼續他博后進行的嗅覺神經方面研究，還是從事他從本科到博士一直進行的干細胞研究。經歷一番掙扎后，李勁松繼續他所熱愛的胚胎發育與細胞重編程研究。
對于很多低等生物來說，如酵母、蕨類植物等，它們可以以單倍體的形式存活。但對于高等生物來說，單倍體只存在其成熟后形成的配子中，如精子和卵子。從嚴格意義上來講，卵子也是雙倍體，因為它只有在受精之后，才會將第二極體排出形成單倍體。單倍體細胞只有一套染色體，降低了基因組的復雜程度，在遺傳分析、基因功能與性狀研究中具有重要的應用價值，因而單倍體細胞是生命科學研究的窗口以及重要工具。然而如何獲得高等動物的單倍體細胞系研究，一直困擾著這一領域的各國科學家。
2012年，李勁松和徐國良合作通過將精子注入去核的卵母細胞中建立小鼠的類精子單倍體細胞系，成功與小鼠的卵細胞結合，產生具有穩定遺傳性狀的幼鼠。這項具有突破性的研究發表在Cell雜志上。
“2012年發表這項研究時，Cell雜志的編輯也認為，建立一個可培養的類精子單倍體細胞系，從概念到技術都很新穎。”李勁松表示。
事實上，無論是人類還是小鼠，從精原干細胞到最后在附睪加工成成熟的精子這一過程非常復雜，精子一旦成熟，結構功能特化，而且不會再分化，如果在體外能建立一個類精子單倍體細胞系，并且能代替精子與卵子結合形成受精卵，意義會很大。
同年，中科院動物研究所研究員周琪、趙小陽也利用小鼠的精子與去核的卵細胞結合形成孤雄單倍體細胞，再與卵細胞進行結合，產生出健康的小鼠。該研究發表在Nature雜志上。
盡管半克隆小鼠的研究結果令人振奮，但是如何將這項技術從概念向工具轉化仍有阻力。研究者發現半克隆小鼠出生效率很低，僅為4.5%，且將近一半的幼鼠出現發育不良的現象。
2013年一整年，李勁松實驗室一直在尋找解決這個問題的關鍵。最終他們發現，雄性印記基因H19在半克隆小鼠中高表達，是導致小鼠出生率低、發育遲緩的關鍵因素。當研究者修復基因H19的表達后，發現半克隆小鼠的出生率顯著提高，但是發育失敗率仍然很高。后來發現另一雄性印記基因Gtl2同樣過表達，于是研究者再將這個基因的表達進行修復，結果小鼠的出生率達到了20%。這一結果顯示，兩個雄性印記基因的過表達，導致小鼠發育率低以及發育異常。
至于半克隆小鼠為何全都是雌鼠，李勁松表示，精子分為兩種，或攜帶X染色體，或攜帶Y染色體，它們進入卵子后分別產生雌性和雄性個體。但是，所有的單倍體干細胞，不管是精子來源，還是卵子來源，全部都是攜帶X染色體的，所以利用單倍體干細胞產生的半克隆小鼠均是雌性。
李勁松進一步解釋，X染色體上有上千個基因，對細胞的生存有著至關重要的作用，細胞如果沒有X染色體是不能存活的，因此不可能從Y染色體的精子中產生單倍體細胞系，后代自然不會出現半克隆的雄性個體。目前的研究發現，這些半克隆小鼠能夠健康長大成年并具有生育能力，至于這些小鼠未來是否存在其它方面的健康隱患，目前還不得而知。
- 當半克隆技術遇到CRISPR/Cas9 -
2013年，李勁松課題組的一篇文章顯示，通過直接向攜帶白內障遺傳缺陷的小鼠受精卵中注入CRISPR/Cas9系統后，即可編輯受精卵的基因達到修復遺傳缺陷的目的。但是，當時的修復效率只有30%，且經過基因編輯的受精卵存在少量的脫靶。
為了解決這兩個問題，2014年，李勁松課題組與北京大學湯富酬實驗室和上海生化與細胞研究所吳立剛實驗室合作，利用CRISPR/Cas9在白內障小鼠精原干細胞中進行遺傳修復并建立一系列的精原干細胞系，通過嚴格分析，選擇修復的并且不攜帶任何脫靶的精原干細胞進行體內移植，用于產生健康的雄性配子，從而實現后代100%不攜帶白內障遺傳缺陷。隨著半克隆技術和CRISPR/Cas9基因編輯技術的日趨成熟，通過兩種技術的結合進行小鼠疾病模型建立或者遺傳疾病的治療研究變得更簡單。
李勁松認為，利用CRISPR/Cas9系統改造生殖細胞主要有兩個策略，一是編輯受精卵，二是編輯生殖單倍體細胞（配子），編輯生殖單倍體細胞更具前景，因為它能在配子結合成受精卵之前進行篩查，從而保障配子的基因改造準確性大大提高，減少CRISPR/Cas9技術由于脫靶帶來的弊端。正由于CRISPR/Cas9技術目前還存在脫靶問題，因此他反對目前將該技術使用在人類生殖細胞基因修飾上。“這會存在很大的風險”，李勁松表示。
- 雄性會逐漸被“忽略”嗎? -
兩個卵子結合產生后代的研究一經發表，立即引起人們的熱議，很多男性開始擔心自己的地位會下降。事實上，男性的半邊天在一連串打擊下飽受壓力：Y染色體的消失、克隆動物的出現以及兩個卵子可產生后代。雄性動物真的會被“忽略”嗎？
1600萬年前，X、Y染色體同時出現，擁有相同的長度，但隨后Y染色體不斷縮短，截至目前其僅為X染色體長度的1/3。澳大利亞拉籌伯大學（La Trobe University）研究員詹妮弗·格拉芙（Jennifer Graves）甚至給出Y染色體450萬年后很有可能會消失的論斷，雄性動物的地位似乎岌岌可危。
自然法則似乎也印證了格拉芙這一令人不安的結論：一種生活在日本的田鼠，在進化過程中竟將自己的Y染色體弄丟，好在它們在細胞的常染色體上重新找到新的性別決定基因，如果不是這樣，那么它們只會落入進化終結的死胡同里，繼而滅絕，從這個星球上消失。它們的現在或許是人類的未來嗎？
正如我們所知，很多動物的繁殖需要精卵結合才可孕育下一代，但對于低等生物個體而言，它們采取無性生殖，即可大量繁衍后代，從而迅速建立種群優勢。稍微高等的一些動物，它們會采取無性和有性生殖結合的繁殖策略，當食物豐盛、氣候適宜時，它們會把精力放在快速增殖上，采取無性生殖策略，當天氣開始變冷，環境惡劣時，雌性個體通常會尋覓雄性個體進行有性生殖，從而產生健壯的后代以度過艱難時刻。脊椎動物營有性生殖，繁殖下一代需兩性結合。
自從克隆動物出現后，這一規則受到嚴峻挑戰。1996年，英國愛丁堡大學科學家伊恩·維爾穆特（Ian Wilmut）利用細胞核移植技術，在全球首次克隆出大型哺乳動物——克隆羊“多莉”，“多莉”沒有父親，它是維爾穆特利用一只羊的乳腺細胞的細胞核與另外一只羊的去核卵細胞結合誕生的，它是人類第一次真正意義上利用“無性生殖”的方式產生出的哺乳動物，隨后貓、狗、豬、牛等動物相繼被克隆出來。
顛覆人們對生殖的認識的科學研究似乎沒有停止的意思。李勁松研究組這項發表在Cell Research雜志上的研究顯示：兩個卵子也能產生出健康的后代。研究人員通過在卵子中建立攜帶基因修飾的單倍體細胞系，然后再將這些細胞與另一只雌鼠的卵細胞結合，之后可高效地產生出健康的小鼠出來。
至于兩個精子是否產生后代，李勁松在接受媒體采訪時如是回答，“精子比卵子小得多、簡單得多。卵子有可能被改變成精子，但反過來就會困難得多。”
- 單倍體細胞系的未來應用 -
事實上，科學家持續開展的單倍體細胞系的研究對生命科學的基礎研究、人類疾病研究的意義遠大于人們對于雄性個體地位可能被“忽略”的擔憂。
2015年上半年，李勁松實驗組成功建立了“類精子細胞”的單倍體細胞系，它們能穩定地與雌鼠的卵細胞結合，產生出半克隆小鼠。由于小鼠研究在人類健康以及癌癥等方面具有很大的參考價值，這些具有穩定遺傳的“類精子細胞”的單倍體細胞系自然意義非凡。
單倍體細胞系的建立，未來有望作為一個工具來使用，研究者可進行多基因的敲除或者敲入實驗。例如，研究者對三個基因的同時表達感興趣，可以通過把這些基因敲入單倍體干細胞中，然后通過卵子注射獲得攜帶三基因同時敲入的半克隆小鼠。
事實上，人類的疾病大多數也是由多基因突變或缺失引起，如果將這些突變基因敲入到單倍體細胞體系中，那么人們就能很好地建立人類疾病的小鼠模型，通過對小鼠的表型研究，有助于人們了解這類疾病的發生以及發展。以往科學家都是基于細胞水平研究人類多基因介導的疾病，很難做到個體水平的研究，現在已經可以通過哺乳動物的個體模型來研究人類的疾病特征。
在采訪結束時，李勁松表示，下一步的主要工作是在靈長類動物身上建立能代替精子使用的單倍體細胞系，從而可以通過注入卵子獲得半克隆猴子，進而更好地研究人類的疾病。
致謝：感謝李勁松老師對本文的修正。
李勁松簡介
中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所研究員，主要進行細胞重編程與胚胎發育方面的研究。
2002年獲中科院動物研究所博士學位，在美國洛克菲勒大學進行5年博士后研究，2007年回國，至今任中科院上海生科院生化與細胞所研究員、上海科技大學生命科學學院特聘教授，并先后獲得何梁何利基金獎、談家楨生命科學獎等獎項。
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3. Wu Y, Zhou H, Fan X, Zhang Y, Zhang M, Wang Y, Xie Z, Bai M, Yin Q, Liang D, Tang W, Liao J, Zhou C, Liu W, Zhu P, Guo H, Pan H, Wu C, Shi H, Wu L, Tang F & Li J. Correction of a genetic disease by CRISPR-Cas9-mediated gene editing in mouse spermatogonial stem cells. Cell Research. 2015.
4. Wu Y, Liang D, Wang Y, Bai M, Tang W, Bao S, Yan Z, Li D & Li Jinsong. Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell. 2013.
5. Yang H, Liu Z, Ma Y, Zhong C, Yin Q, Zhou C, Shi L, Cai Y, Zhao H, Wang H, Tang F, Wang Y, Zhang C, Liu X, Lai D, Jin Y, Sun Q & Li J. Generation of haploid embryonic stem cells from Macaca fascicularis monkey parthenotes. Cell Research. 2013.
6. Yang H, Shi L, Wang B, Liang D, Zhong C, Liu W, Nie Y, Liu J, Zhao J, Gao X, Li D, Xu G-L & Li Ji. Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells. Cell. 2012.
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