寫這個(gè)記錄的緣由，是我在生信技能樹上看到這樣一篇文章：

生信技能樹-文章的最高境界-讓人無法重復(fù)出來？？？

在《Single-cell analyses reveal increased intratumoral heterogeneity after the onset of therapy resistance in small-cell lung cancer》這篇文章中，作者將10x Genomics單細(xì)胞測序的數(shù)據(jù)上傳到了GEO: GSE138267。但當(dāng)我們想從 ENA 數(shù)據(jù)庫下載相應(yīng)的.fastq原始數(shù)據(jù)時(shí)，卻發(fā)現(xiàn)每個(gè) RUN 只有一個(gè).fastq文件：

由于現(xiàn)在10x Genomics 的 Cellranger 流程要求輸入的.fastq文件至少有R1（cell barcode和UMI序列）和 R2（插入片段），直接從 ENA 下載的單個(gè).fastq顯然不能用于 CellRanger，必須另找辦法。

1. 探索 Run Browser

我們在 SRA 的 Run Browser 中隨便查看一下 SRR10211573 的基本信息：

我們注意到下面的 Show 2 additional attributes，點(diǎn)開后可以看到fastq-load.py及其參數(shù)：

fastq-load.py --output=<archive path> <other options> <fastq files> | general-loader

我沒有細(xì)看 github 上的源代碼，根據(jù)輸出結(jié)果中的<archive path>推測它是把多個(gè).fastq文件合并成一個(gè).sra文件。那么理論上說完整的.sra文件里應(yīng)該包含完整的三部分 reads，利用sra-toolkit中的fastq-dump提取出這些文件并用于 Cellranger！

2. sra-toolkit

• 配置sra-docker

這里我搭建了一個(gè) docker 鏡像：yuchenlee/sra-toolkit:2.10.8：

docker pull yuchenlee/sra-toolkit:2.10.8

• 利用prefetch下載.sra文件：

docker run --rm \
  -v /home/lyc/lyc-1995/ncbi/:/home/mydocker/ncbi/ \
  --user=1000 \
  yuchenlee/sra-toolkit:2.10.8 \
  prefetch SRR10211573 --max-size 50000000

掛載宿主機(jī)目錄時(shí)最后一個(gè)文件夾要命名為ncbi，數(shù)據(jù)默認(rèn)會(huì)下載到ncbi/sra。搭建鏡像的時(shí)候我忘了在里面配置aspera了，下載速度有點(diǎn)慢……

• 利用fastq-dump提取 reads 文件：

docker run --rm \
  -v /home/lyc/lyc-1995/ncbi/:/home/mydocker/ncbi/ \
  --user=1000 \
  yuchenlee/sra-toolkit:2.10.8 \
  fastq-dump --split-files --gzip --outdir ./ncbi/fastq  SRR10211573

• 得到了 3 個(gè).fastq.gz文件，對應(yīng) Run Browser 中的 reads per spot：

cd ~/lyc-1995/ncbi/fastq/
tree -hl

.
├── [6.8G]  SRR10211573_1.fastq.gz
├── [21.3G]  SRR10211573_2.fastq.gz
└── [3.1G]  SRR10211573_3.fastq.gz

0 directories, 3 files

其實(shí)從文件大小也大致能看出三者的關(guān)系來了。

3. Cellranger

按照 Cellranger 的要求重命名：

mv SRR10211573_1.fastq.gz SC16-LB17028_S1_L001_R1_001.fastq.gz
mv SRR10211573_2.fastq.gz SC16-LB17028_S1_L001_R2_001.fastq.gz
mv SRR10211573_3.fastq.gz SC16-LB17028_S1_L001_I1_001.fastq.gz

就可以愉快地跑 cellranger count啦！

4. ENA 和 SRA 不一致

在源代碼中查看fastq-load.py的參數(shù)--readTypes=TBT：

--readTypes: 

For specifying read types using B (Biological) or T (Technical) 
Use sequence like TBBT - no commas. Defaults to BB. Must be 
consistent with number of values specified for read lengths. 
If you want the read sequence to be used as the spot group or 
part of the spot group use G (Group). Multiple reads incorporated 
into the spot group will be concatenated with an '_' separator.

在我們這個(gè)例子中，R2是Biological reads，R1和I1都是Technical reads。我猜測 ENA 在同步 SRA 中的數(shù)據(jù)時(shí)，默認(rèn)只同步Biological reads，這可能就是為什么我們直接從 ENA 下載數(shù)據(jù)只得到一個(gè).fastq。而且在fastq-dump參數(shù)中，也有選擇丟棄Technical reads的選項(xiàng)--skip-technical。但我谷歌了一大圈，并沒有找到官方的說明，有人甚至認(rèn)為這可能是作者上傳 ENA 時(shí)的失誤……

其實(shí)要驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們可以比較一下從 ENA 下載的.fastq文件和fastq-dump輸出的結(jié)果：

• 分別展示前 4 行

head -n 4 SRR10211573_2.fastq 

@SRR10211573.1 K00384:78:HLM37BBXX:3:1101:27630:1261 length=98
CATTTTGTANTACGGGGATACCTGNGACTGCACCNTTAAAAAATATATTTATCATTTAANTCTTGGGTAANCACACTTCATAACAGAGNAGAGNGANT
+SRR10211573.1 K00384:78:HLM37BBXX:3:1101:27630:1261 length=98
A<<-----<#--7--7---77A-7#7JJFAAJ7J#7-FF-<--<--77--77AF<----#-<<----<77#FJ-<-AJ--7--7-7--#-7-<#--#-

head -n 4 SRR10211573.fastq 

@SRR10211573.1 K00384:78:HLM37BBXX:3:1101:27630:1261/2
CATTTTGTANTACGGGGATACCTGNGACTGCACCNTTAAAAAATATATTTATCATTTAANTCTTGGGTAANCACACTTCATAACAGAGNAGAGNGANT
+
A<<-----<#--7--7---77A-7#7JJFAAJ7J#7-FF-<--<--77--77AF<----#-<<----<77#FJ-<-AJ--7--7-7--#-7-<#--#-

堿基序列部分是完全一樣的。

• 統(tǒng)計(jì)一下 reads 數(shù)：

grep -c "@" SRR10211573_2.fastq

284914819

grep -c "@" SRR10211573.fastq

284914819

5. 其他

其實(shí)今年還有一篇文章上傳的數(shù)據(jù)也是類似的情況：
Single-cell transcriptomic atlas of the human endometrium during the menstrual cycle