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Cicero是一個用于分析單細胞染色質可及性實驗的R工具包。Cicero的主要功能是使用單細胞染色質可及性數據，通過分析共同可及性來預測基因組中的順式調控相互作用（如增強子和啟動子之間的相互作用）。此外，Cicero包還擴展了Monocle的功能，能夠利用染色質可及性數據對單細胞進行聚類，排序和差異可及性分析。

Cicero包的簡介

Cicero包的主要功能是使用單細胞染色質可及性數據來預測基因組中更可能位于細胞核附近的區域。這可用于鑒定潛在的增強子-啟動子互作對，并了解全基因組區域內的順式相互作用的整體結構。

由于單細胞數據的稀疏性，細胞必須根據相似度進行聚合，以對數據中的各種技術因素進行可靠的校正。最終，Cicero根據用戶給定的距離，計算在指定距離內每個可及性peaks對之間的開放性，并給出"Cicero co-accessibility"得分，其分數介于-1和1之間，得分越高，表示更高的共可及性（co-accessibility）。

此外，Cicero包還提供了擴展工具包，可使用Monocle提供的框架來分析單細胞ATAC-seq數據。
Cicero包提供了兩種主要的分析功能：

構建和分析順式調控網絡。 Cicero通過分析共可及性（co-accessibility），來識別鑒定潛在的順式調控相互作用，并使用各種技術對其進行可視化和分析。
常規單細胞染色質可及性分析。 Cicero還擴展了Monocle包，以使用單細胞染色質可及性數據來進行差異可及性（differential accessibility）分析，細胞聚類與可視化，和發育軌跡重建。

Cicero包的安裝

通過Bioconductor進行安裝

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
  install.packages("BiocManager")
# 安裝依賴包
BiocManager::install(c("Gviz", "GenomicRanges", "rtracklayer"))
BiocManager::install("cicero")

# 加載cicero包
library(cicero)

通過Github進行安裝

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
    install.packages("BiocManager")
# 安裝依賴包
BiocManager::install(c("Gviz", "GenomicRanges", "rtracklayer"))
install.packages("devtools")
devtools::install_github("cole-trapnell-lab/cicero-release")

# 加載cicero包
library(cicero)

數據集的加載

Cicero將數據存儲在CellDataSet（CDS）類的對象中，該類繼承自Bioconductor的ExpressionSet類。我們可以使用以下三個函數來操作該對象：

fData: 獲取feature的元信息
pData: 獲取cell/sample的元信息
exprs: 獲取cell-by-peak的count矩陣

為了修改CDS對象以保留染色質可及性數據而不是表達數據，Cicero使用peaks作為feature數據而不是基因或轉錄本。具體來說，許多Cicero函數需要形式為chr1_10390134_10391134的peaks值信息，如下所示：

image

Loading data from a simple sparse matrix format

Cicero可以讀取以簡單稀疏矩陣格式存儲的數據，這里以Cicero包自帶的一個小數據集cicero_data為例。

# 加載示例數據集
data(cicero_data)
# 查看示例數據
head(cicero_data)
                       Peak                                 Cell Count
140 chr18_30209631_30210783 AGCGATAGGCGCTATGGTGGAATTCAGTCAGGACGT     4
150 chr18_45820294_45821666 AGCGATAGGTAGCAGCTATGGTAATCCTAGGCGAAG     2
185 chr18_32820116_32820994 TAATGCGCCGCTTATCGTTGGCAGCTCGGTACTGAC     2
266 chr18_41888433_41890138 AGCGATAGGCGCTATGGTGGAATTCAGTCAGGACGT     2
273 chr18_33038287_33039444 AGCGATAGGGTTATCGAACTCCATCGAGGTACTGAC     2
285 chr18_25533921_25534483 ATTACTCGAACGCGCAGAGGCGGAGGTCGTACTGAC     1

為了方便起見，Cicero提供了一個名為make_atac_cds的函數。該函數以稀疏矩陣格式將data.frame或文件的路徑作為輸入。具體來說，此文件應該是由三列組成的制表符分隔的文本文件。第一列是peak的坐標，格式為“ chr10_100013372_100013596”，第二列是細胞的名稱，第三列是整數，表示細胞在該peak重疊的讀取次數，且此文件不應包含標題行，如下所示：

image

# 使用make_atac_cds函數將稀疏矩陣轉換為CDS對象
input_cds <- make_atac_cds(cicero_data, binarize = TRUE)

# 查看CDS對象
input_cds
CellDataSet (storageMode: environment)
assayData: 6146 features, 200 samples 
  element names: exprs 
protocolData: none
phenoData
  sampleNames: AGCGATAGAACGAATTCGGCGCAATGACCCTATCCT
    AGCGATAGAAGTACGCGATCCGCGGACTGTACTGAC ...
    TCTCGCGCTCTTGAGGTTTTATGACCAAATAGAGGC (200 total)
  varLabels: cells Size_Factor num_genes_expressed
  varMetadata: labelDescription
featureData
  featureNames: chr18_10025_10225 chr18_10603_11103 ...
    chr18_78015362_78016311 (6146 total)
  fvarLabels: site_name chr ... num_cells_expressed (5 total)
  fvarMetadata: labelDescription
experimentData: use 'experimentData(object)'
Annotation:  

# 查看feature的metadata
head(fData(input_cds))
                              site_name chr    bp1    bp2
chr18_10025_10225     chr18_10025_10225  18  10025  10225
chr18_10603_11103     chr18_10603_11103  18  10603  11103
chr18_11604_13986     chr18_11604_13986  18  11604  13986
chr18_49557_50057     chr18_49557_50057  18  49557  50057
chr18_50240_50740     chr18_50240_50740  18  50240  50740
chr18_104385_104585 chr18_104385_104585  18 104385 104585
                    num_cells_expressed
chr18_10025_10225                     5
chr18_10603_11103                     1
chr18_11604_13986                     9
chr18_49557_50057                     2
chr18_50240_50740                     2
chr18_104385_104585                   1

# 查看cell的metadata
head(pData(input_cds))
                                                                    cells
AGCGATAGAACGAATTCGGCGCAATGACCCTATCCT AGCGATAGAACGAATTCGGCGCAATGACCCTATCCT
AGCGATAGAAGTACGCGATCCGCGGACTGTACTGAC AGCGATAGAAGTACGCGATCCGCGGACTGTACTGAC
AGCGATAGAATACGATAAGGCCGTCAACTAATCTTA AGCGATAGAATACGATAAGGCCGTCAACTAATCTTA
AGCGATAGATTATGCAAGCCAGTACTTGCCTATCCT AGCGATAGATTATGCAAGCCAGTACTTGCCTATCCT
AGCGATAGCAGACTAAGGGGAATTCAGTGGCTCTGA AGCGATAGCAGACTAAGGGGAATTCAGTGGCTCTGA
AGCGATAGCCGTATGATTAGATCTTGGTCAGGACGT AGCGATAGCCGTATGATTAGATCTTGGTCAGGACGT
                                     Size_Factor num_genes_expressed
AGCGATAGAACGAATTCGGCGCAATGACCCTATCCT          NA                 290
AGCGATAGAAGTACGCGATCCGCGGACTGTACTGAC          NA                 490
AGCGATAGAATACGATAAGGCCGTCAACTAATCTTA          NA                 253
AGCGATAGATTATGCAAGCCAGTACTTGCCTATCCT          NA                 181
AGCGATAGCAGACTAAGGGGAATTCAGTGGCTCTGA          NA                  85
AGCGATAGCCGTATGATTAGATCTTGGTCAGGACGT          NA                 251

# 查看cell-by-peak的count矩陣
head(exprs(input_cds))
6 x 200 sparse Matrix of class "dgCMatrix"
   [[ suppressing 32 column names 'AGCGATAGAACGAATTCGGCGCAATGACCCTATCCT', 'AGCGATAGAAGTACGCGATCCGCGGACTGTACTGAC', 'AGCGATAGAATACGATAAGGCCGTCAACTAATCTTA' ... ]]
                                                                           
chr18_10025_10225   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
chr18_10603_11103   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
chr18_11604_13986   . 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
chr18_49557_50057   . . 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
chr18_50240_50740   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
chr18_104385_104585 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
                                  
chr18_10025_10225   . . . . ......
chr18_10603_11103   . . . . ......
chr18_11604_13986   . . . . ......
chr18_49557_50057   . . . . ......
chr18_50240_50740   . . . . ......
chr18_104385_104585 . 1 . . ......

 .....suppressing 168 columns in show(); maybe adjust 'options(max.print= *, width = *)'
 ..............................

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Loading 10X scATAC-seq data

如果我們的scATAC-seq數據來自10x Genomics平臺，使用Cell Ranger ATAC軟件處理將數據輸出到一個名為filtered_peak_bc_matrix的文件夾中，可以通過以下方式將數據轉換為CDS對象。

加載cell-by-peak的count矩陣
# read in matrix data using the Matrix package
indata <- Matrix::readMM("filtered_peak_bc_matrix/matrix.mtx") 
# binarize the matrix
indata@x[indata@x > 0] <- 1

# 加載cell的metadata
# format cell info
cellinfo <- read.table("filtered_peak_bc_matrix/barcodes.tsv")
row.names(cellinfo) <- cellinfo$V1
names(cellinfo) <- "cells"

# 加載peak的metadata
# format peak info
peakinfo <- read.table("filtered_peak_bc_matrix/peaks.bed")
names(peakinfo) <- c("chr", "bp1", "bp2")
peakinfo$site_name <- paste(peakinfo$chr, peakinfo$bp1, peakinfo$bp2, sep="_")
row.names(peakinfo) <- peakinfo$site_name

row.names(indata) <- row.names(peakinfo)
colnames(indata) <- row.names(cellinfo)

# 使用newCellDataSet函數構建CDS對象
# make CDS
fd <- methods::new("AnnotatedDataFrame", data = peakinfo)
pd <- methods::new("AnnotatedDataFrame", data = cellinfo)
input_cds <-  suppressWarnings(newCellDataSet(indata,
                            phenoData = pd,
                            featureData = fd,
                            expressionFamily=VGAM::binomialff(),
                            lowerDetectionLimit=0))

input_cds@expressionFamily@vfamily <- "binomialff"
input_cds <- monocle::detectGenes(input_cds)

# 數據初步過濾
#Ensure there are no peaks included with zero reads
input_cds <- input_cds[Matrix::rowSums(exprs(input_cds)) != 0,]

參考來源：https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/docs/

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