質控原則

好的結果需要好的數據。
原始下機測序數據(raw data)中，有些reads包含有測序接頭序列，這些序列不屬于測序物種中的原有序列，因此質控過程中需要剪切去除。同時，下機數據中還包含許多低質量的reads序列（如平均測序質量值較低的reads,序列某些位置堿基質量值過低，含N較多的reads等），同樣需要過濾去除。
質控核心思想：trim(剪切)+fliter(過濾)

軟件

使用fastp和fastqc作為質控軟件。fastp主要用來剪切和過濾reads，fastqc用以生成更詳細的質控報告。

fastp參數選擇

文件讀寫及程序運行基本選項：
-i，輸入文件1，雙端測序raw reads R1；
-o，輸出文件1，雙端測序clean reads R1；
-I，輸入文件2，雙端測序raw reads R2；
-O，輸出文件2，雙端測序clean reads R2；
-6，輸入fastq文件phred格式為phred64，將其轉化為phred33，輸出fastq文件phred33；
-z，gzip壓縮水平，取值1-9，數值越高壓縮空間越小但速度越慢，默認為2；
-j，輸出的json文件名稱，默認fastp.json；
-h，輸出的html文件名稱，默認fastp.html；
-w，程序運行線程數，默認3線程；
-s，可根據指定文件個數拆分文件，默認不拆分；
-S，可根據指定行數拆分文件，默認不拆分；
reads接頭序列裁剪功能：
-A，若此參數存在，則關閉裁剪測序接頭序列功能，默認啟用；
-a，接頭序列，默認自動檢測；
reads全局裁剪功能：
-f，裁剪reads1 5'端該長度的堿基，默認無；
-t，裁剪reads1 3'端該長度的堿基，默認無；
-F，裁剪reads2 5'端該長度的堿基，默認無；
-T，裁剪reads2 3'端該長度的堿基，默認無；
reads polyG裁剪功能：
-g，執行polyG裁剪功能；默認情況下，僅識別Illumina NextSeq/NovaSeq數據執行polyG裁剪；
-G，關閉polyG裁剪功能；默認情況下，僅識別Illumina NextSeq/NovaSeq數據執行polyG裁剪；
reads滑窗裁剪功能：
-5，在reads 5'端啟用根據堿基質量值的裁剪，默認無，（該參數啟用會影響后續分析中對deduplication數據的識別）；
-3，在reads 3'端啟用根據堿基質量值的裁剪，默認無，（該參數啟用會影響后續分析中對deduplication數據的識別）；
-W，設定reads裁剪的滑窗大小，默認4堿基為一滑窗；
-M，滑窗中堿基平均質量低于該設定閾值時，將被裁剪，默認閾值為q20；
reads過濾功能（根據堿基質量、N堿基數量、長度等）：
-Q，若此參數存在，則關閉質量篩查功能，默認啟用；
-q，設定期望堿基質量值，質量值低于該值的堿基視為不合格，默認值15表示phred quality >= q15合格；
-u，允許reads中存在多少個堿基不合格，取值0-100，默認值40表示40%；
-n，如果一個read中的N堿基大于此設定值，該read將被剔除，默認值為5；
-L，若此參數存在，則關閉長度篩選功能，默認啟用；
-l，如果一個read的長度低于此設定值，該read將被剔除，默認值為15；
reads堿基校正功能：
-c，若為雙端測序數據（paired-end reads，PE reads），可根據reads重疊區執行堿基校正，默認禁用；
對帶分子標簽（UMI）的數據處理功能：
-U，啟用unique molecular identifer (UMI)程序；
Over-represented序列分析功能：
-p，啟用over-represented reads分析；
-P，統計over-represented reads在指定測序擴增循環次數中的基本信息，默認第20輪循環。

舉例

使用fastp默認參數質控后fastqc顯示的質控報告（read1的）

基本信息

堿基測序質量

堿基分布情況

根據圖中顯示的問題（第80個堿基往后質量值較低，5'端序列質量值波動）進行參數調整
代碼：

fastp -w 7 -f 9 -F 9 -3 -W 1 -M 20 -q 20 -u 40 -l 116 -i control_P_R1.fq.gz -I control_P_R2.fq.gz -o control_P_R1.p.fq -O control_P_R2.p.fq -h p.html

-w 7 線程數為7
reads全局裁剪功能
-f 9 全局裁剪，所有reads1 從5'端剪去9個堿基
-F 9 全局裁剪，所有reads2 從5'端剪去9個堿基

reads滑窗裁剪功能
-3 在reads 3'端啟用根據堿基質量值的裁剪
-W 設定reads裁剪的滑窗大小為1，默認4堿基為一滑窗；數值越小，窗口所包含的堿基越容易被切除 非常之關鍵
-M 20 滑窗中堿基平均質量低于該設定閾值時，將被裁剪，默認閾值為20

reads過濾功能
-q 20 設定期望堿基質量值，質量值低于該值的堿基視為不合格
-u 40 允許reads中存在多少個堿基不合格，取值0-100，默認值40表示40%（若-u 30 一條read允許有30％的堿基不合格（Q值設為20）,超過30％被過濾掉）
-q 20 -u 40 一個read最多只能有40%的堿基的質量值低于Q20，否則會被過濾掉
-l 116 如果一個read的長度低于116，該read將被剔除，默認值為15 （l值得確定是根據全局剪切的參數設置的，如果測序策略為PE125，-f 為5，此時大部分reads長度為116，-l的值此時就設為116，若設為125，則所有reads都被過濾掉了）

ps:滑窗裁剪和接頭序列裁剪（-a,默認開啟）都是局部裁剪

fastqc形成更清晰的質控報告

fastqc -o ~/WGBS/1_RawData/insulin.fastqc insulin_P_R1.fastp.fq insulin_P_R2.fastp.fq

調整fastp參數質控后的結果

堿基測序質量

堿基分布情況

fastqc和fastp同時執行:

fastp -w 7 -f 9 -F 9 -3 -W 1 -M 20 -q 20 -u 40 -l 116 -i insulin_P_R1.fq.gz -I insulin_P_R2.fq.gz -o insulin_P_R1.fastp.fq -O insulin_P_R2.fastp.fq -h insulin_P.html;fastqc -o ~/WGBS/1_Raw
Data/insulin.fastqc insulin_P_R1.fastp.fq insulin_P_R2.fastp.fq

參考

生信工具Fastp的安裝及其在二代測序數據過濾質控中的使用說明
fastp: 極速全能的FASTQ文件自動質控 過濾 校正 預處理軟件
RNA-seq從過濾低質量到去接頭完整質控步驟