前言：從今天開始就開始為拼裝轉錄組做準備啦，今天聽了技能樹組織的生信人論壇，感覺很有意思。特此聲明：本文所有代碼及文件經通過本人親自實踐！絕對沒有副作用！當然希望大家多提出寶貴意見，這樣可以方便我更好的學習和進步。

特別注意：本文所用數據已經經過Trimmomatic清洗！

Basic Statistics

總覽，來判斷測序質量

圖1 Basic Statistics

Encoding：測序平臺信息，我也不知道這個樣本的測序信息對不對，所以這里就沒有辦法深入解釋了。

Total Sequences：測序獲得的reads數目，測序質量的重要評價手段。

Sequences flagged as poor quality：標記為差的堿基序列，這個貌似沒有神馬用處

Sequence length：測序獲得長度

%GC：整個測序中堿基GC所占比例，一般有物種特異性。

注意：Sequence length GC

Per base sequence quality

圖2 Per base sequence quality

橫坐標：堿基所在的測序位置，這個一般根據不同測序平臺會有不同。

縱坐標：測序質量。20%代表錯誤為1%的錯誤讀取率，30%代表0.1%的錯誤讀取率。

圖例：箱線圖，25-50-75%代表數據所處位置。

注意：理論來說好的測序結果應該都在綠色和黃色區域，紅色區域代表測序質量較差。

Per tile sequence quality

圖 3 Per tile sequence quality

橫坐標：堿基所在的測序位置，這個一般根據不同測序平臺會有不同。

縱坐標：tile的index編號（tile應該是flow cell - lane - tile中的單位。

注意：也是判定測序質量好和不好的依據，整張圖應該以冷色調為主，如果出現大量暖色，則證明某些tail測序有些問題，在后期的處理過程中可以刪掉那些暖色的tail。

Per sequence quality scores

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從read的總體質量判定這次測序的質量，是質量分析的重要標準之一。

橫坐標：測序質量。20%代表錯誤為1%的錯誤讀取率，30%代表0.1%的錯誤讀取率。

縱坐標：在該質量值下的read數目。

注意：峰應該集中在高質量區間，即圖像起始點最好大于20。

Per base sequence content

圖4 Per base sequence content

橫坐標：還是堿基的數目

縱坐標：堿基的百分比

注意：ATCG堿基分布應該差異不大。兩條緊挨著的線：AT、CG誤差應小于10%，若大于該比值則認為測序風險大。由于測序儀調整造成前幾個測序結果略有誤差，同時也有同學指出可能是含有接頭序列所導致的堿基偏好，可以通過后期工作將前幾個堿基刪掉。在本案例中由于測序質量很好，就沒有進行刪除操作（ps 查了幾個資料，大家爭議比較大，建議還是根據自身情況進行確定，至于刪除與否建議參考biostar相關的帖子）。

Per sequence GC content

圖5 Per sequence GC content

橫坐標：每個read的平均GC比

縱坐標：該GC比下，read的數量

注意：藍色是理論值，測序結果趨向藍色越好。如果有其它污染會導致雙峰圖樣。

Per base N content

圖6 Per base N content

橫坐標：又是堿基數目。

縱坐標：N（未知堿基）所占比例。

注意：未知堿基數目越少越好。

Sequence Length Distribution

[圖片上傳失敗...(image-ee9921-1564222758518)]

橫坐標：read的長度，本文中應該是125。

縱坐標：代表在該長度下read數目的多少。

Sequence Duplication Levels

圖7 Sequence Duplication Levels

橫坐標：序列重復等級

縱坐標：重復數量

注意：在測序建庫PCR過程中，由一些基因擴增次數過多導致。重復次數為一次的比例越高越好。但由于本文中使用的是轉錄組數據，偏高正常，一旦移除會對后面定量分析計算帶來困擾。

Overrepresented sequences

圖8 Overrepresented sequences

大量重復序列：FastQC檢測出的大量重復序列。

Adapter Content

圖9 Adapter Content

橫坐標：又又又是堿基所在位置。

縱坐標：接頭所占比例。

注意：當FastQC參數中 -a中沒有參數時，默認使用四種lillmina接頭進行匹配。

Kmer Content

圖10 Kmer Content

橫坐標：又又又又是相同的內容。

縱坐標：觀測值和預測值的比值。

注意：啥是K-mer啊？具體可以看參考資料5。其實就是一段短小的重復序列。

圖11 K-mer統計圖

這是前面k-mer=5時（軟件默認）生成的表格，主要用于檢查數量情況。

參考資料：

1. (3)轉錄組之數據質控 http://www.lxweimin.com/p/2ed3622ed4a8

2. 【轉錄組入門】3：了解fastq測序數據 https://www.cnblogs.com/chenpeng1024/p/9166988.html

3. 利用fastqc檢測原始序列的質量 http://www.lxweimin.com/p/a1eb03d63083

4. Question: Sequence duplication levels-RNA Seq https://www.biostars.org/p/307361/

5. Kmer content http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=16262

6. FastQC analyses of trimmed MiSeq reads kmer content http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=40646

7. Question: Kmer content failed in FastQC analysis https://www.biostars.org/p/340112/