DNA的甲基化一般是抑制DNA表達的，即基因的甲基化水平越高，表達水平則越低，精子和大多數體細胞都符合這種模式。然而在卵細胞基因組中，許多轉錄惰性區呈現低甲基化特征。這種獨特的甲基化模式是怎么形成的，對早期胚胎的發育潛能有什么影響還不清楚。
2018年11月28日中國科學院生物物理研究所的朱冰研究員團隊在Nature雜志上發表了名為Stella safeguards the oocyte methylome by preventing de novo methylation mediated by DNMT1的研究成果，發現Stella通過引導UHRF1出核，抑制UHRF1和DNMT1介導的卵細胞基因組甲基化；敲除Stella則會引起卵細胞基因組高甲基化，進而影響合子基因組激活和胚胎植入前的發育。
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背景介紹
DNA甲基化
DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferases, DNMTs）作用下，DNA胞嘧啶（C）的第5位碳原子獲得一個甲基，轉變為5-甲基胞嘧啶（5-mC）。DNMTs主要分為兩類，即維持性DNA甲基轉移酶和從頭甲基化酶，前者主要指DNMT1，使DNA在復制過程中能將母鏈的甲基化模式穩定遺傳給子鏈，后者包括DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L，能將未甲基化或低甲基化的區域甲基化。DNMT3L自身并沒有DNA甲基轉移酶活性，主要是增強DNMT3A和DNMT3B的酶活性。
Stella
Stella又名Dppa3（developmental pluripotency-associated 3）或PGC7（primordial germ cell 7），主要表達于原始生殖細胞（primordial germ cell, PGC）、植入前胚胎和其他多能干細胞，在早期胚胎發育和多能性維持中有重要作用。Stella對雌性的生殖能力很重要，既往研究顯示，Stella缺陷的雌性小鼠受精后產生的胚胎多停滯在植入前階段，很少能達到囊胚期。Stella還能夠抑制Tet3介導的DNA去甲基化，從而維持母源基因組的甲基化狀態。
Uhrf1
Uhrf1（ubiquitin like with PHD and ring finger domains 1）一個多功能的表觀遺傳調控因子，參與調控DNA甲基化和多種組蛋白翻譯后修飾。DNMT1是一種自我抑制性甲基轉移酶，受UHRF1調控。UHRF1能夠特異性地識別和結合半甲基化的DNA鏈，并招募DNMT1至DNA鏈，解除DNMT1的自我抑制性，對新生子鏈進行甲基化。
合子基因組激活
哺乳動物生殖細胞在減數分裂過程中和受精后形成的早期胚胎中，其基因組是轉錄靜止的，直到受精卵分裂幾次后，其基因組才開始轉錄，表達新的基因，這一事件叫做合子基因組激活（zygotic genome activation, ZGA）。ZGA之前，胚胎的發育主要由母源因子調控。
方法與結果
1 Stella通過出核信號引導Uhrf1出核
作者在體細胞中過表達Stella，發現能引起DNA去甲基化，同時發現Stella與Uhrf1存在相互作用?？紤]到Stella和Uhrf1在卵細胞發生過程中都高表達，作者就想在小鼠卵細胞中探究一下Stella是否調控Uhrf1。
在D5~D15的正常對照卵細胞中（Stella+/-，因為卵細胞是單倍體，所以半合子就是正常狀態），Stella均勻分布，Uhrf1主要分布于細胞質中，而敲除Stella后，Uhrf1主要分布于細胞核，直到D20才出現在細胞質中，但細胞核中一直存在。在HEK293細胞中過表達Stella，能使UHRF1主要分布于細胞質。
以上說明Stella能夠引導Uhrf1出核，那么Stella是如何引導Uhrf1出核的呢？
作者用輸出蛋白特異性的抑制劑LMB（leptomycin B）處理過表達Stella的HEK293細胞，能夠阻止Stella引導的Uhrf1出核，使Uhrf1主要分布于細胞核。過表達出核信號序列突變的Stella（Stella(NESmut)）同樣不能引導Uhrf1出核，盡管Stella(NESmut)與Uhrf1仍存在相互作用。由此說明Stella主要通過出核信號引導Uhrf1出核。
此外，作者過表達一種與Uhrf1親和力減退但出核信號正常的Stella(KRR)突變體(K85E/R86E/R87E)，可引導部分Uhrf1出核，細胞核內仍有Uhrf1殘留，提示Stella引導Uhrf1出核需要Stella與Uhrf1相互作用。
2 Stella通過Uhrf1阻止卵巢基因組過度甲基化
第一部分證明了Stella能夠引導Uhrf1出核，那么出核的意義是什么呢？
考慮到Uhrf1參與調控DNA甲基化，作者對不同階段的卵細胞進行甲基化檢測，發現Stella?/? MⅡ卵細胞的總體甲基化水平增加了2倍。異常高甲基化區域主要位于各種類型的重復序列和發育相關基因，印記基因的甲基化水平未發生明顯變化。
選擇一些獨特的100bp片段，若其在D5卵細胞的甲基化水平<25%，而在MⅡ卵細胞的甲基化水平>75%，則定義為卵子發生獲得的甲基化區域（oogenesis-acquired methylated regions, ooAMRs）。在正常對照卵細胞中，這些ooAMRs稱為normal ooAMRs，有28661個。敲除Stella后，這些normal ooAMRs大多（96.5%）能正常建立，除此之外，作者還發現了28122個extra ooAMRs。
在Uhrf1和Stella雙敲除的卵細胞中，那些extra ooAMRs完全消失，其甲基化譜與Uhrf1單敲除的MⅡ卵細胞相似，提示Stella?/? MⅡ卵細胞的異常高甲基化是由Uhrf1介導的。
那么Stella?/? MⅡ卵細胞的異常高甲基化對卵細胞的基因轉錄和胚胎發育有沒有影響呢？
Stella?/? MⅡ卵細胞的異常高甲基化對基因組轉錄只產生輕度影響，大多數啟動子區或CpG島（CpG islands, CGIs）異常高甲基化的基因在對照組卵細胞中已處于沉默狀態，而Stella?/? MⅡ卵細胞的異常高甲基化偏好發生于失活基因的啟動子區和CGIs。
作者構建了Stella和Uhrf1分別單敲或雙敲的卵細胞，觀察其受精后胚胎發育情況（Fig. 2d），發現Stella單敲除的胚胎發育到囊胚期的比例最低，其次是Stella和Uhrf1雙敲除。
3 Stella缺陷對受精卵和胚胎發育的影響
Stella?/? MⅡ卵細胞的異常高甲基化對卵細胞基因表達只有輕度影響，那它對受精卵的基因轉錄，尤其是合子基因組激活有無影響呢？
我們知道，受精卵發育初期會發生大規模甲基化擦除，去除雙親的甲基化記憶，然后重新建立甲基化，于是作者首先探究了Stella?/? MⅡ卵細胞的異常高甲基化能否在這一輪甲基化擦除活動中幸免。
作者比較了Stella+/+和Stella△m/+受精卵雌原核的normal ooAMRs和extra ooAMRs的相對去甲基化水平（relative demethylation level, RDL）,發現normal ooAMRs的RDL無明顯差異，而extra ooAMRs有相當一部分沒有去甲基化（Fig. 3a）。作者同時觀察了Stella+/+和Stella△m/+受精卵雄原核的總體RDL水平，發現Stella△m/+受精卵雄原核的RDL水平降低，推測是由雌原核的高甲基化競爭去甲基化酶所致，UHPLC–MS/MS檢測發現雄原核5hmC水平降低證明了這一推測。UHPLC–MS/MS同時檢測了受精卵總體的5mC和5hmC水平，發現Stella△m/+受精卵總體的5mC和5hmC水平增加（Fig. 3c）。
作者接下來檢測了Stella?/? MⅡ卵細胞從MⅡ階段到受精形成的雌原核和兩細胞胚胎階段，normal ooAMRs和extra ooAMRs的CG甲基化變化，發現這一過程中Stella?/?卵細胞的normal ooAMRs甲基化無明顯變化，extra ooAMRs的甲基化水平明顯升高（Fig. 3d）。
對兩細胞胚胎進行RNA-seq，發現Stella△m/+兩細胞胚胎的基因表達明顯下調。作者著重觀察了合子基因組激活（ZGA）基因，即只有12個ZGA基因能正常激活，167個ZGA基因表達下調（Fig. 3e），且ZGA缺陷基因的甲基化水平明顯升高（Fig. 3f）。
為了確定Stella?/? MⅡ卵細胞對基因表達和胚胎發育的影響是由細胞核還是細胞質所致，作者進行了紡錘體移植實驗（Fig. 3g），發現細胞核、細胞質同時敲除對ZGA基因表達和胚胎發育的影響最大，其次是細胞質敲除，再次是細胞核敲除（Fig. 3h-i），但細胞核敲除的ZGA缺陷基因甲基化程度高于細胞質敲除（原文Extended Fig. 7d）。
4 Stella敲除后的異常甲基化依賴DNMT1
背景介紹中提到甲基化轉移酶主要有3種，那么Stella?/? MⅡ卵細胞的異常甲基化是哪一個酶催化的呢？
作者用免疫熒光檢測了正常對照和Stella?/?卵細胞中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的表達，發現在對照和Stella?/?卵細胞中DNMT3B根本檢測不出來，DNMT3As亞細胞定位無明顯變化，DNMT1在對照卵細胞中主要定位于細胞質，而敲除Stella后，DNMT1在中心體周圍有點狀分布（Fig. 4a-b），Uhrf1在此位置也有分布，而敲除Uhrf1后，DNMT1不再在中心體周圍分布（Fig. 4c），提示DNMT1在中心體周圍的分布呈Uhrf1依賴性。同時作者觀察到敲除Stella后，卵子發育過程中主要衛星重復序列的甲基化水平明顯增加（Fig. 4d）。
為了明確DNMT1和DNMT3A中究竟是哪一個負責Stella?/?卵細胞的異常甲基化，作者分別構建了Dnmt1和Dnmt3a敲除的卵細胞，進行甲基化檢測，發現敲除Dnmt1能明顯降低Stella?/?卵細胞的甲基化水平，而敲除Dnmt3a對其無明顯影響（Fig. 4e），說明Stella?/?卵細胞的異常甲基化主要依賴于DNMT1。
結論
敲除Stella能使卵細胞的UHRF1和DNMT1異常聚積于核內，對卵細胞基因組進行重新甲基化，影響合子基因組激活和胚胎植入前的發育。卵細胞正常表達的Stella能夠通過出核信號引導UHRF1出核，避免UHRF1和DNMT1對卵細胞基因組進行過度甲基化。
學霸筆記
套路分析
這篇文章作者觀察到敲除Stella能使卵細胞的UHRF1發生異位，然后探究此現象的意義。因為UHRF1能夠調控DNA的甲基化，作者便從DNA的甲基化著手，發現敲除Stella能引起卵細胞基因組的異常甲基化，并且此異常甲基化依賴于UHRF1。DNA甲基化可以影響DNA表達水平，所以作者同時檢測了它對卵細胞基因組表達的影響。
高甲基化的卵細胞受精后會不會對受精卵和胚胎發育產生影響呢？于是作者檢測了Stella?/?卵細胞對受精卵甲基化擦除、合子基因組激活和胚胎發育的影響，并通過紡錘體移植實驗進一步明確到底是細胞核還是細胞質缺陷造成的這些影響。
Stella?/?卵細胞基因組的異常甲基化是哪一個甲基轉移酶催化的呢？作者通過分別敲除Dnmt1和Dnmt3a，明確了Stella?/?卵細胞基因組的異常甲基化由Dnmt1催化，并依賴于UHRF1。
閃光點與不足
這篇文章的閃光點我覺得主要在于兩方面，一是揭示了卵細胞基因組低甲基化的原因，二是發現維持性甲基轉移酶DNMT1也有重新甲基化的作用。
不足之處，原文討論中也有提及，就是DNMT1的重新甲基化作用究竟是對DNMT3A催化的半甲基化的CpG島進行甲基化還是完全自己重新甲基化，文章沒有明確證明，雖然作者根據已有證據傾向于后者。
對學霸的啟發
這篇文章用的是反證法，通過把Stella敲除出現的一系列異常，證明Stella的作用，感覺挺繞的，學霸看的很痛苦，一開始根本看不懂（充分說明了功力不夠），不過看懂之后的成就感也是大大的。
暫時還沒想到如何跟自己的課題結合起來，不過倒是提醒自己，不要拘泥于已有的概念，如本文正因為突破了DNMT1維持性甲基轉移酶的傳統觀點，所以才更顯突出吧。
希望本文能給你以啟發。
