參考：
利用orthofinder尋找單拷貝基因構建系統發育樹 - 簡書 (jianshu.com)
創建conda環境，我個人命名為orthofinder，在該環境下用conda就可安裝orthofinder，muscle，mafft，seqkit，phyml軟件。
其他軟件prottest,RAxML可以官網下載，安裝就看README或者INSTALL。比如prottest，最后還要把phyml軟鏈到bin下，比如RAxML，make命令選一個跟自己系統匹配的運行一個就夠了，不用運行全部四個。
1 Othofinder運行
首先激活環境，然后可以后臺運行以下命令
orthofinder -f your/pep/fa/file/
我沒加線程參數，所以十個物種的大概運行2-4個小時。生成文件中會有 Single_Copy_Orthologue_Sequences文件夾。
。
2.對生成的單拷貝同源序列進行批量處理，比對。
在Single_Copy_Orthologue_Sequences文件夾下運行
$ vi 01.muscle.sh
#!bin/bash
for i in *.fa
do muscle -in $i -out $i.1 #新版本的muscle命令變了。
#或者do muscle -align $i -output $i.1
done
運行后多出一些后綴為.1的文件。*.1文件是比對好的序列文件。
3.提取保守序列
$ vi 02.gblock.sh
conda activate orthofinder
cd PATH/TO/Single_Copy_Orthologue_Sequences
for i in *.1
do Gblocks $i -b4=5 -b5=h -t=p -e=.2
done
會生成一堆后綴是*.1.2的文件。
4.把序列排序，合并
$ vi 03.seqkit.sh
conda activate orthofinder
cd OrthoFinder/Results_May20/Single_Copy_Orthologue_Sequences
for i in *.2
do seqkit sort $i >$i.3
seqkit seq $i.3 -w 0 > $i.3.4
done
這里參考教程新建了文件夾new 把.4后綴的文件移到文件夾里然后
$ mkdir new
$ mv *.4 new/
$ cd new
$ paste -d " " *.4 > all.fa
$ sed -i "s\ \\g" all.fa
得到all.fa文件。
5.處理數據，將fa文件轉為phy格式
vi 04.fa2phy.py
#!usr/bin/python
import re
with open('all.fa', 'r') as fin:
sequences = [(m.group(1), ''.join(m.group(2).split()))
for m in re.finditer(r'(?m)^>([^ \n]+)[^\n]*([^>]*)', fin.read())]
with open('all.phy', 'w') as fout:
fout.write('%d %d\n' % (len(sequences), len(sequences[0][1])))
for item in sequences:
fout.write('%-20s %s\n' % item)
$ java -jar /your/software/to/prottest3-master/dist/prottest-3.4.2.jar -i all.phy -all-distributions -F -AIC -BIC -tc 0.5 -threads 24 -o prottest.out
得到蛋白模型。
6.RAxML構樹
$ vi RAxML.sh
/your/path/to/01.Software/standard-RAxML-master/raxmlHPC-PTHREADS-SSE3 -T 16 -f a -x 123 -p 123 -N 1000 -m PROTGAMMAIJTTF -k -O -o Ensete_ventricosum,Musa_a,Musa_b \
-n all.rename.tre -s all_rename.fa
qsub提交任務就可。十個物種大概運行1小時。
這里-o選項是定根，我的外群是芭蕉。如果不定外群，結果會很奇怪。
還有就是。-s參數后接的fa文件，其實是把每個物種的單拷貝同源序列合并成超長一條。最好把ID改成相應的物種。不然ID太長也會報錯。
然后我用的besttree復制到figtree軟件或者iTOL，就可以出圖了。
注：我只選了同一“目”下的一些物種，我要研究的五種物種的基因組，加上近緣物種選了五種，一共是十種。因為很近，所以gblocks可以運行。因為我想在更多的物種比如單子葉和雙子葉選了13種的時候gblocks好像選不出來保守基因，可能是單拷貝同源基因太少了。（個人推測）
個人覺得這種單純的樹沒啥用，后續還要加分化時間（r8s等）還有CAFE分析。
