在這一段歷史中，人們的生命隨時都有可能驟然熄滅，伊莎貝拉對此都有體驗。阿方索也被各種推測指向了中毒而亡，數千年中的艱難時代，毒藥常常在王位繼承中發揮重要作用。在伊莎貝拉時代，人民在談到用毒藥殺人時常常提及“草藥”——毒芹、屋頭、洋地黃和蒿。編年史家們推測阿方索就是被他們所說的草藥毒死的。
但是也有一種觀察，阿方索的死不符合當時現有的任何一種毒藥，疾病在當時確實也是無處不在的威脅。14世紀50年代的黑死病沖中國通過絲綢之路來到歐洲，據說殺死了歐洲人口的四分之一。
將人毒死的好處是成功毒殺可以模仿自然疾病，這樣就較難發現真實死因。胡安二世的第一任妻子和葡萄牙往后這對阿拉貢姐妹在相繼幾天內死去，據說被毒死。
中世紀晚期向文藝復興過渡的階段，大約就是在伊莎貝拉長大成人的時期，毒藥的流行程度大大提升。威尼斯和羅馬在當時都出現了傳授毒藥技術的學校。在意大利半島，下毒害人的現象司空見慣，以至于出現了一個新詞“被意大利”，意思就是被毒死。
阿方索的死使得伊莎貝拉成了王位繼承人，這倒使得她陷入了不利境地，最終通過宣布弟弟病逝，并宣布效忠恩里克四世得以和解，順利的拿到了王位繼承人。1468年9月19日兩人在吉桑的田野會面以下是一些原文描寫：在這風聲蕭瑟的原野，伊莎貝拉起這一頭騾子趕來，象征性地展示自己的謙遜態度。大教主徒步陪伴她，在隨后的典禮上，她被正式指定為王儲。她也宣誓盡在得到恩里克四世批準的情況下才會結婚。恩里克把承諾給伊的城鎮和阿斯圖里亞斯親王領地都給了她。
此時胡安娜由于和恩里克四世分居時剩下了教主的孩子，進一步喪失了名譽。由于隨后胡安娜的作怪又使得恩里克四世食言，準備再次把伊莎貝拉嫁到國外，胡安娜使更多的人相信小胡安娜才是國王的親生女兒，因為恩里克也確實愛這個孩子，所以對剝奪她的繼承權感到恥辱而出爾反爾。隨后伊迎來了很多追求者，恩里克四世四世認真考慮了其中的四位：英格蘭愛德華四世的弟弟、法蘭西王室幼支貝里公爵（法蘭西國王路易十一的弟弟）、剩下的兩位都來自伊比利亞半島，都是她的親戚——葡萄牙國王阿方索五世，還有一位也是她最喜愛的人，費迪南，童年時代就相信會成為自己真命天子的人。雖然也被恩里克拒絕，但是即將十八歲的伊莎貝拉已經開始秘密與費迪南談婚論嫁。
