導言

今天小編分享一篇2021年4月9日發表于Cell的有關免疫治療的文章——Glioblastomas acquire myeloid-affiliated transcriptional programs via epigenetic immunoediting to elicit immune evasion.多形性膠質母細胞瘤（GBM）是一種侵襲性腦腫瘤，目前的免疫治療方法尚未成功。在此，研究者探討GBM中免疫逃避的新機制。通過將GBM干細胞（GSCs）連續移植到具有免疫活性的宿主中，獲得具有逃避免疫清除的能力的GSC。從機制上講，這不是通過腫瘤亞克隆的遺傳選擇引起的，而是通過表觀遺傳免疫編輯過程引起。在免疫攻擊后，GSCs中的穩定轉錄和表觀遺傳變化得到加強。這些變化啟動了骨髓細胞相關的轉錄程序，從而導致與腫瘤相關的巨噬細胞的募集增加。此外，在人間充質亞型GSCs中發現相似的表觀遺傳學和轉錄特征。全文結論：表觀遺傳免疫可能通過重塑腫瘤免疫微環境（TME），在最具侵襲性的間充質GBM亞型中驅動獲得性免疫逃逸程序。

結論

??免疫活性GBM小鼠模型中疾病相關TME的重現

??免疫攻擊后GSCs中轉錄組的穩定重組

??免疫逃逸的GSCs部署“髓樣擬態”以建立富集髓樣的TME

??獲得性轉錄變化與表觀遺傳免疫編輯過程一致

結果展示

工程化GSCs通過免疫活性宿主連續移植獲得免疫逃逸能力

有研究表明，GBM由具有神經干細胞（NSC）特征的細胞驅動；基因工程小鼠模型和患者樣品的基因組分析表明，內源性NSC可能是GBM的起源細胞。因此，研究者從C57BL/6 J（BL6）小鼠分離的NSC中構建了一組等基因GBM干細胞（GSCs），通過引入5種已確定的GBM驅動基因突變中的1種：EGFRvIII或PDGFRA過表達，CRISPR/Cas介導的Nf1、Pten或Trp53的敲除。這些單基因敲除的GSC表達典型的NSC標記物（NESTIN和SOX2），并保持分化為神經元和星形膠質細胞的能力。接下來，生成突變的組合以對間充質亞型進行建模。首先，通過共同敲除Nf1和Pten（NP細胞）制備了雙突變型NSC。將GFP[+] NP細胞原位移植到免疫低下（NOD-scid-gamma [NSG]）小鼠體內，導致形成小的良性生長。只有進一步用EGFRvIII過表達進行改造，形成三重突變細胞系（NPE）才觀察到體內具有GBM預期特征的極具侵襲性的腫瘤生長和浸潤。此外，還構建了一種與前神經元亞型相對應的腫瘤起始細胞系（PPP），其腫瘤侵襲性遠不及NPE。

反向相蛋白陣列（RPPA）分析證實了突變NSCs中RTK和PI3K信號通路的激活，包括ERK、Ras、Raf、mTor、Akt和Src表達的升高。已知GBM的前神經亞型具有較低的免疫浸潤和免疫抑制性TME，而NPE細胞更具攻擊性，以及它們與免疫逃逸性最強的間充質GBM亞型的對應關系，研究者更專注于用NPE模型探索免疫逃逸機制。

實驗證實，NPE細胞在具有免疫能力的同系BL6宿主中具有致瘤性，這使研究者能夠對GBM細胞與免疫TME之間的相互作用進行建模。在免疫功能低下的NSG小鼠中形成的腫瘤作為對照相比發現，BL6小鼠中NPE腫瘤的出現速度比NSG小鼠中慢（分別為25-50天和15-20天），并且大多數BL6宿主可以長期存活。這些與BL6宿主免疫系統對NPE細胞的反應并限制其腫瘤形成是一致的。

研究者推斷，通過從宿主進行系列移植后，從逃避免疫監視的BL6小鼠的腫瘤中獲得原代GSCs培養物，可以富集具有獲得性免疫逃逸能力的細胞。因此，從BL6小鼠的NPE腫瘤（NPE-BL6-TD）建立了新鮮的培養物。NPE-BL6-TD細胞被移植到第二級BL6宿主中，形成頻率更高的腫瘤。然后，將從這些繼發性腫瘤（NPE-IE）中重新獲得的GSCs培養物移植到第三級BL6宿主中。移植了NPE-IE細胞的小鼠顯示腫瘤形成增加，存活率明顯低于先前移植的品系。但是，將NPE和NPE-IE細胞移植到對照NSG小鼠中時，顯示出相似的致瘤性，并且沒有發現NPE-IE細胞在體外具有增殖優勢。總之，這些結果表明NPE-IE細胞具有免疫逃逸能力。

免疫逃逸型NPE-IE腫瘤具有高度免疫抑制的微環境

為了確認NPE-IE腫瘤是否由于逃逸T細胞清除能力而更具侵略性，研究者分別耗竭了NPE，NPE-BL6-TD和NPE-IE腫瘤的BL6小鼠中的CD8 T細胞群。在所有情況下都觀察到腫瘤生長加快，腫瘤滲透率逐漸增加。這證實了NPE細胞系及其衍生物產生的腫瘤不會發生抗原丟失，而CD8 T細胞介導的清除正是它們主動逃逸的原因。

接下來，利用流式細胞術，比較了非腫瘤腦組織中與NPE或NPE-IE腫瘤腦組織中存在的免疫細胞類型。在荷瘤腦中，我們觀察到總的腦免疫細胞儲備發生了重大變化，包括巨噬細胞和CD8/CD4 T細胞（M1和M2樣巨噬細胞的標志物）的顯著增加，以及小膠質細胞的明顯減少。此外，我們觀察到荷瘤腦中的淋巴群顯示出功能障礙的標志物，如PD-1和TIM3的表達。重要的是，腫瘤和鄰近組織的熒光免疫組織化學表明主要的巨噬細胞群（F4/80[+]?Iba1[+]）局限于腫瘤塊，并且在整個大腦中通常不增加。

直接分離腫瘤腫塊以進一步表征腫瘤免疫微環境。多參數流式細胞儀數據顯示NPE-IE腫瘤中的免疫細胞浸潤較NPE腫瘤增加。重要的是，NPE-IE腫瘤中的單核細胞骨髓源性抑制細胞（M-MDSCs）和巨噬細胞顯著增加，腫瘤浸潤的巨噬細胞表達PD-L1的水平明顯高于小膠質細胞。與NPE腫瘤相比，沒有觀察到NPE-IE腫瘤中巨噬細胞表型轉換的證據；相反，在每種情況下，巨噬細胞表現出典型的吞噬和抗原呈現表型（即CD86[+]和CD11c[+]），以及免疫抑制標記物PD-L1。自然殺傷細胞（NK）和樹突狀細胞群沒有明顯變化。

阻斷CSF-1R信號傳導降低NPE-IE細胞的免疫逃逸能力

以往的研究表明巨噬細胞集落刺激因子1受體（CSF-1R）是治療膠質瘤的一個潛在靶點。為了確定募集到NPE-IE腫瘤中的巨噬細胞是否支持免疫逃逸，在BL6小鼠中使用針對CSF-1R的靶向抗體耗竭這些細胞，這導致了腫瘤存活率的提高。在免疫功能不受影響的NSG移植對照中，該治療無明顯影響。因此，腫瘤相關巨噬細胞在維持BL6小鼠NPE-IE腫瘤的生長和免疫逃逸中起著關鍵作用。

雖然NPE-IE腫瘤中各種T細胞群的頻率沒有顯著差異，但是發現PD-1和LAG3標記物陽性的CD8和CD4 T細胞群增加。這表明NPE-IE TME表現出T細胞功能障礙的升高狀態和增強的免疫抑制功能。如前所述，兩種腫瘤類型中的巨噬細胞對PD-1配體PD-L1的表達呈高度陽性，我們發現小膠質細胞對LAG3配體MHC-II的表達呈陽性，這表明除了TAM募集外，還存在其他免疫抑制途徑。結果發現NPE來源的腫瘤可以逐漸逃避CD8 T細胞的清除，并建立一個越來越多的富含髓細胞和促腫瘤基因的TME，并伴隨著T細胞衰竭。

免疫逃逸細胞在免疫攻擊后發生顯著的轉錄重組

為了揭示在NPE-IE細胞中觀察到的獲得性免疫逃逸機制，研究者對其基因組、轉錄組和表觀基因組進行了表征。重要的是，NPE和NPE-IE細胞的核型分析和全基因組測序（WGS）在比較時均未發現明顯的遺傳破壞。這表明在NPE-IE腫瘤中觀察到的獲得性免疫逃逸特性并不是克隆進化或經典的遺傳免疫編輯過程所能解釋的。因此推測NPE-IE細胞可能已經獲得了其他支持免疫逃逸的細胞內在的和穩定的基因表達變化。

研究者對一組細胞進行了mRNA-seq分析，包括單個突變系和來源于NSG腫瘤的細胞（無免疫攻擊的體內微環境暴露的參考對照）。引人注意的是，在單個突變系中，Nf1缺失表現出最接近完全轉化的NPE突變體的轉錄組。僅Nf1缺失富集與GBM相關的幾個基因特征，包括顯著激活血管生成和細胞遷移途徑。這與間充質亞型中觀察到的血管生成特征增加一致，表明Nf1的缺失可能是惡性轉化的“原發”細胞。

然而，重要的是，免疫逃逸品系（NPE-BL6-TD和NPE-IE）獲得明顯不同的轉錄模式，這不能單獨用Nf1缺失來解釋，包括許多免疫相關基因。其中NPE-IE細胞中幾種趨化因子的上調，特別是Ccl9，可解釋NPE-IE腫瘤髓樣細胞含量的增加。在免疫活性宿主細胞中上調的另一個有趣的候選基因是Irf8（干擾素調節因子8）。Irf8是一種髓樣特異性的主轉錄因子，通常在造血細胞中專門表達，并且在髓樣譜系和巨噬細胞分化中具有已知作用。Irf8在NSC中通常是沉默的，因此，在免疫攻擊后，NPE細胞可能會不適當地“劫持”骨髓主調節轉錄因子的表達。總之，這些發現表明，體內免疫攻擊顯著觸發了NPE細胞中的轉錄變化。

NPE-IE系中的免疫逃逸由表觀遺傳免疫編輯所支持

鑒于體內免疫攻擊后誘導的轉錄變化在體外擴增后能穩定保留，研究者推斷可能發生了表觀遺傳變化。利用亞硫酸氫鹽還原代表性測序（RRBS）分析了全基因組DNA甲基化水平。主成分分析（PCA）顯示了三個不同的組，并且在體內移植的細胞中發現了顯著的低甲基化水平。NPE-BL6-TD和NPE-IE細胞系通過PCA緊密地聚集在一起，并且與NPE細胞相比表現出廣泛的低甲基化水平。與mRNA-seq數據一致，免疫逃逸細胞中的許多差異去甲基化基因與免疫過程有關。

最重要的差異甲基化區域之一出現在Irf8啟動子區和基因體中，甲基化在NPE-BL6-TD和NPE-IE系中逐漸消失，與轉錄激活增加一致。這些DNA甲基化模式的變化提示了“表觀遺傳學免疫編輯”過程。在該過程中，由免疫攻擊引起的轉錄變化得以穩定，并被選擇用于那些具有較高免疫逃逸能力的細胞中。這將導致高度免疫逃逸和轉錄改變的后代。有趣的是，研究者還發現其他免疫逃逸調節因子包括Nt5e（CD73）和Cd274（PDL1）都存在甲基化丟失，這與這些基因在體內被重新激活有關。?

Irf8對NPE細胞中IFN-γ和TAMs有重要作用

有研究表明，Irf8通過IFN-γ誘導的STAT1信號在巨噬細胞中被激活。在NPE-IE細胞系中，對IFN-γ的反應是一個富集的狀態，因此研究者假設來自免疫TME的慢性IFN-γ信號可能刺激NPE細胞中Irf8表達的激活。通過將免疫原性NPE細胞暴露于IFN-γ，直接在體外進行測試。實驗發現，IFN-γ處理后，Irf8在NPE-BL6-TD或NPE-IE細胞中可以更快地達到更高水平。這與Irf8位點DNA甲基化缺失后快速轉錄激活的啟動一致。在體外，未免疫的NPE細胞中I型IFN信號傳導（通過IFN-α/β處理誘導）不能誘導與IFN-γ相同程度的Irf8表達。此外，JAK/STAT抑制劑托法替尼逆轉了NPE細胞中Irf8的表達，但未能逆轉NPE-IE細胞中Irf8的表達，這表明在NPE-IE細胞中存在JAK/STAT獨立的機制，以維持Irf8的高表達。此外，直接分離的GFP[+]?NPE-BL6-TD和NPE-NSG-TD腫瘤細胞的譜分析證實了關鍵基因的激活發生在體外擴增之前（例如Irf8，H2-Ab1）。因此，將NPE細胞暴露于具有免疫能力的體內環境足以誘導這些觀察到的轉錄變化。

為了確定NPE-IE腫瘤TME內的免疫細胞類型，從NPE腫瘤中分離免疫細胞，并在體外與親代NPE細胞共培養。數據顯示，浸潤性巨噬細胞群（F4/80[+]，CD45[hi]）可以刺激免疫原性NPE細胞中與NPE-BL6-TD和NPE-IE細胞中觀察到的類似的轉錄變化。這表明浸潤的巨噬細胞可能是體內信號的來源，例如IFN-γ可驅動這種反應。此外，盡管前神經PPP細胞在體內不能有效地生成腫瘤或顯示免疫逃逸能力，但是研究者認為PPP細胞仍可能對NPE腫瘤源性免疫細胞共培養產生反應，因為在患者腫瘤中，前神經亞型可以轉變為間充質細胞。

PPP細胞與從NPE腫瘤分離的免疫細胞的體外共培養表明，類似的轉錄程序可在神經模型中激活。接下來構建了NPE-IE Irf8敲除細胞系，這些表現出較低的攻擊性表型，并且出現的腫瘤的動力學與未經免疫的NPE細胞移植的小鼠相似。綜上表明，Irf8的激活是NPE-IE細胞免疫逃逸的重要因素，并且可能通過IFN-γ介導的體內激活而發生。

人GSCs有兩種主要的轉錄亞型并且間充質GSCs由IFN信號傳導決定

為了評估這些的發現是否與人類疾病相關，研究者對36種低傳代患者來源的GSCs培養物進行了RNA-seq和分子亞型分析。通過分析體外擴增的GSCs，發現了兩種不同的亞型：S1，稱之為非間充質免疫標記（non-MES[Imm]）；S2，稱之為間充質免疫標記（MES[Imm]）。這些元基因模塊的富集與之前發表的基于全腫瘤轉錄本的標記性質相關。一個不同的轉錄譜與MES[Imm]亞型相關，包括與IFN信號相關顯性特征。

值得注意的是，在富含MES[Imm]的GSCs中觀察到幾個干擾素調節因子家族成員的上調，包括Irf8和Irf7。但是，Irf1的關聯更為明顯。人Irf1也是一種IFN-γ反應性轉錄因子，據報道在髓樣細胞的發育中與hIrf8一起發揮作用。此外，還發現MES[Imm]中CCL2的表達增加，這可能解釋了間充質GBM中觀察到的免疫種群增加。最后，證實了工程化NPE細胞中這種MES[Imm]的富集，隨著細胞系獲得免疫逃逸能力（即NPE-IE細胞）而增加。因此，在MES[Imm]人類GBM中也觀察到了與小鼠模型中未發現的相關特征。重要的是，在沒有IFN信號的情況下，這些轉錄特征在長期培養中是穩定且可遺傳的。這與轉錄組穩定變化的表觀遺傳事件一致。通過將這些發現與獨立的，可公開獲得的單細胞RNA-seq（scRNA-seq）數據的分析進行比較，進一步驗證了MES[Imm]和Non-MES[Imm]亞型。

人MES[Imm]-GBMs與NPE-IE細胞顯示相似的DNA甲基化變化

為了評估富含MES[Imm]的人GBMs是否也能反映小鼠模型的DNA甲基化變化，在患者來源的GSCs中分析了DNA甲基化水平，結果觀察到MES[Imm]亞型中DNA甲基化水平明顯下降。此外，對來自患者GSCs的單樣本基因集富集分析（ssGSEA）表明，在MES[Imm]亞型中觀察到的低水平的DNA甲基化與先前發表的間充質標記相關，并且可能與相關免疫途徑（如IFN-γ反應）的激活有關。值得注意的是，在MES[Imm]樣品中，發現了與小鼠模型（包括Irf 1，CCL2和Irf 8）中確定的基因和途徑相關的CpG島上的甲基化缺失。這些人類GBM細胞的轉錄重組和表觀遺傳變化與小鼠模型中觀察到的過程相似。因此，使用與在NPE-IE小鼠細胞中鑒定的機制相似的機制，人GBM還可進行表觀遺傳學免疫編輯，以穩定這種免疫逃逸狀態。

總結

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總體而言，研究者發現表明，GBM腫瘤中所觀察到的亞型同一性的梯度或連續性可以通過腫瘤免疫微環境侵蝕其表觀遺傳環境和改變轉錄因子調控網絡的程度來解釋。轉錄和表觀遺傳重構以及髓系譜系特異性轉錄因子和轉錄模塊的共同選擇是在TME中發生免疫攻擊后發生的腫瘤細胞內在反應。此外，探索巨噬細胞募集，保留和極化的相對作用，以及其他免疫細胞群的作用，需要進行更加深入的研究。盡管研究者對人類特征的分析與結論是一致的，但是還需要進一步直接測試免疫細胞或細胞因子對其轉錄狀態的影響。將需要更深入的特征描述和測試（PPP）模型，以明確在此確定的途徑對間充質亞型的特異性。