A single-cell transcriptome atlas of the adult human retina
遺傳性視網膜疾病正成為成人失明的主要原因，當前已鑒定到與視網膜疾病相關的200多個基因，涉及特定的視網膜細胞類型。
先前對于成人和胎兒的視網膜遺傳表達譜已有研究，但是關于視網膜細胞異質性的研究較少，對高度分化的視網膜細胞的轉錄通路依然不清楚。
因此，了解人類單個視網膜細胞類型的轉錄組情況對于解析視網膜中的細胞多樣性以及研究導致單個視網膜細胞類型疾病的視網膜基因非常重要。
本研究通過對三個健康捐贈者視網膜scRNA-seq數據進行分析，為人類視網膜細胞類型的轉錄組表達譜提供了新的見解，并為人類神經視網膜建立了高細胞分辨率的參考對象。
材料：
- 1、三個捐贈者的視網膜scRNA-seq數據
- 2、胚胎視網膜數據（scRNA-seq）和hiPSC-derived cone photoreceptors(bulk-RNA seq)
前期捕獲到23000個細胞，經質控和過濾得到20009個細胞。
數據分析：
CellRanger 2.1.0版本
參考基因組：GRch38
Seurat V2.2.1
Identification of major cell types in the human retina using scRNA-seq
- 圖A.B：三個捐贈者的視網膜單細胞轉錄組測序數據，使用seurat經過濾篩選，獲得20009個細胞，降維聚類形成18個cluster，B展示的是三個樣本cluster分布。
- 圖c-d:基于已知的makers,18個cluster中的16個進行分類，其中c5和c14表達的maker基因來自多個細胞類型，沒有進行定義。從分類看出，視桿細胞有6個cluster，雙極細胞有3個cluster。(每個圓圈的大小表示在集群中表達makergene的細胞的百分比)
- 圖e:鑒定到的18個cluster進行相關性分析，相同的細胞類型高度相似，除此之外，視桿細胞和視錐細胞以及膠質細胞和其他視網膜神經元有高度相關性。（上面的三角形表示相關的z值，下面的三角形表示聚類中基因表達的相關系數）
- 圖f:對每個cluster進行差異基因表達分析。（選擇差異基因上調表達的前10個基因進行展示）
總而言之，我們在提供的數據集中對人視網膜中所有主要細胞類型的轉錄組進行了分析。由于它們的豐度，在隨后的分析中，我們重點研究了感光細胞（視桿細胞和視錐細胞）和神經膠質細胞。
Profiling healthy and degenerating human rod photoreceptor subpopulations
分析健康和退化人的視桿細胞亞群
- 圖a:分析14759個視桿細胞，形成6個cluster，選取已知的7個maker基因在16個cluster中熱圖展示，1,6,7表達量在視桿細胞很高，4在視桿細胞和視錐細胞都表達。（棕色表示大于等于100的轉錄數量）
- 圖b：六個視桿細胞亞群三個樣本的細胞所占比列。發現許多視桿細胞cluster主要來自單個樣本。C3來自三個捐贈者。（這可能是由于系統的偏見，如組織檢索時間的差異，捐贈者的年齡，或其他樣本制備的變異）
- 圖c:為了定義和分類視桿細胞的異質性，使用了MALAT1（長的非編碼RNA，在視網膜穩定和疾病其重要作用）基因鑒定。約66%的細胞表達高，其余的細胞表達量低。
利用MALAT1表達作為鑒定基因，研究了高表達（MALAT1-hi；每細胞> 4.68標準化轉錄本）或低表達（MALAT1-lo；每細胞<4.68標準化轉錄本）的視桿細胞之間的差異。
通過MALAT1表達的差異能夠區分視桿細胞的異質性
圖d:利用MALAT1表達分析三個樣本（五個文庫）中MALAT1-hi和MALAT1-lo的細胞比列，三個樣本中高表達分別占66%，90%，36%。
圖e:為了近一步證實，進行的原位雜交。outer nuclear layer （外核層）(ONL). INL, inner nuclear layer（內核層）; OPL, outer plexiform layer（外網狀層）
為了排除有樣本變異造成的MALAT1視桿細胞亞群的存在，使用典型性相關分析進行矯正（其用來矯正視桿細胞樣本特異性變異）。
對于CCA，我們使用了所有五個樣品共有的可變性最高的基因，并使用前兩個CC尺寸（通過雙權中間相關（bicor）分析選擇）對重組數據進行了比對。 使用頭20個對齊的CC尺寸以0.6的分辨率在Seurat中重新排列對齊的細胞
- 圖a,b：校正后，視桿細胞亞群形成3個cluster，最終圖中展示了13個cluster。b是三個捐贈者視網膜樣本的展示。
- 圖c：對7個視桿細胞的maker基因進行熱圖展示，
- 圖d,e：對基因MALAT1在視桿細胞的三個cluster的表達豐度的展示，cca0表達豐度低，在cca1和cca10表達豐度高，結果與原位雜交結果一致。上述結果也表明了MALAT1異質性并不是由個體之間的差異造成的。
- 圖f:為了檢驗數據中是否還有低質量細胞，t-sne圖展示8個核糖體蛋白基因，沒有上調表達。
- 圖g:然而，在clustercca10中有1.4%的細胞表達線粒體基因相關的蛋白，可能該cluster含有低質量的細胞。
- 圖4：隨后對不同時間點的視網膜細胞進行原位雜交，結合上面的結果表明MALAT1可以作為判斷視桿細胞處于退化還是健康的狀態。
Transcriptome profile of cone subtypes in the human retina
隨后對視錐細胞進行分析
- 圖a:選取11個maker gene進行分析，通過視錐細胞marker基因的表達，在轉錄組數據中鑒定到564個視錐細胞。視錐細胞可以根據表達的視蛋白劃分為三種亞型（s.m.l）,但是m和l蛋白98%是相似的。
- 圖b,c:展示3種視錐細胞亞型在c10cluster中細胞比列。
- 圖d:進一步研究視錐細胞亞群的分子鑒定maker基因及表達豐度，通過篩選的差異基因對視錐細胞進行亞群區分。結合前人研究結果和本文數據顯示TBX2 marks 是 S-cones 中特異表達,很保守。
Assessment of glial cells in human retina
視網膜神經膠質細胞評估
主要研究兩類視神經膠質細胞型：Mu¨ller glia c9, 和 retinal astrocytes c16（視網膜星型膠質細胞）
- 圖e：展示了9個在神經膠質細胞中常用的maker基因。結果顯示，這9個基因在兩類細胞中的表達水平是不同的。VIM, GLUL, and S100A1兩類細胞高表達； GFAP represents a reliable marker for retinal astrocytes。
通過這些差異基因的表達豐度，可以將兩類細胞型進行區分。
這些結果提供了關于人類神經膠質細胞和視網膜星形膠質細胞中已知神經膠質標記的差異表達模式的見解.
Using the human neural retina transcriptome atlas for benchmarking
為了證明我們的數據集可以作為基準參考，將自己數據與胎兒的視錐細胞，誘導的多能干細胞形成的視錐細胞進行比較。
圖a:相關性分析，結果顯示： hiPSC-cone在分化15周后的轉錄組表達譜與視錐細胞高度相似，與其他的視網膜細胞相似度很低。
- 圖b：通過主成分分析，展示數據之間的相關性。hiPSC-cone與胎兒的視錐細胞比較相近。
另一個基準測試，評估成年人體內細胞與體外細胞系之間的差異 - 圖c:我們將永生的神經膠質細胞系MIO-M1與我們數據集所有視網膜細胞類型進行了比較。使用scRNA-seq，我們對7,150個MIO-M1細胞進行了分析，歸一化后每個細胞具有23,987個讀數，對應于3421個檢測到的基因。
聚類和t-SNE分析表明，MIO-M1細胞形成了一個cluster，cluster與數據集中的視網膜細胞類型不同。 - 圖d和e:相關性分析顯示：MIO-M1與星形膠質細胞相似性更高，e展示的是該類細胞中的基因的表達豐度。
scGPS能夠將混合群分解cluster（SCORE）并分析cluster之間的關系（scGPS）。 scGPS根據預測的基因去定義了亞種群。
這個包有兩種算法：SCORE 和scGPS
scGPS從一個或多個未知樣本的scRNA數據中劃分亞群以及這些亞群之間的關系。 輸入數據集包含混合的、異質細胞。 scGPS首先使用SCORE（或CORE V2.0）來鑒定同質的亞群。 scGPS可以驗證由SCORE標識的子種群（例如，用于與PCA，tSNE和插補方法CIDR的結果進行比較的功能）。 scGPS還可以選擇maker gene區分亞群以及通過富集分析以注釋亞群。
在第二階段，scGPS選擇最佳基因預測并建立可以估計亞種群間過渡分數的預測模型，亞種群間過渡分數是來自一個亞種群的細胞可能過渡到另一亞種群的概率。
scGPS
A_single-cell_transcriptome_atlas_of_the_adult_human_retina
