Author: Marijori A. Matzke and Rebecca A. Mosher
Journal: Nature Review Genetics
doi: 10.1038/nrg3683
link: RNA-directed DNA methylation: an epigenetic pathway of increasing complexity
Abstract
Abstract | RNA-directed DNA methylation (RdDM) is the major small RNA-mediated epigenetic pathway in plants. RdDM requires a specialized transcriptional machinery that comprises two plant-specific RNA polymerases — Pol IV and Pol V — and a growing number of accessory proteins, the functions of which in the RdDM mechanism are only partially understood. Recent work has revealed variations in the canonical RdDM pathway and identified factors that recruit Pol IV and Pol V to specific target sequences. RdDM, which transcriptionally represses a subset of transposons and genes, is implicated in pathogen defence, stress responses and reproduction, as well as in interallelic and intercellular communication.
RNA指導的DNA甲基化是植物中小RNA參與的表觀遺傳調控的主要方式。RdDM的實現需要由兩個植物特有的兩個RNA聚合酶Pol IV and Pol V以及大量的輔助蛋白構成的轉錄復合體的參與，這些輔助蛋白的功能在RdDM途徑中的作用還沒有完全搞明白。最近的工作揭示了經典的RdDM途徑的變化，同時鑒定出可以將Pol IV and Pol V募集到目標基因上的一些因子。RdDM可以在轉錄水平抑制轉座子，基因（表達），參與到了植物抗病，脅迫應答，再生以及與等位基因間（interallelic）和細胞間的通信。
小RNA調控基因表達
Overview
RNA interference (RNAi) is an umbrella term that describes gene silencing phenomena triggered by small RNAs.
- (post-transcription gene silencing, PTGS)在細胞質中，siRNA通過在轉錄后加工過程中對complementary mRNAs的降解和抑制來沉默基因表達.
- (transcriptional gene silencing, TGS)在細胞核內，小RNA通過對基因組同源區域的表觀遺傳修飾例如DNA胞嘧啶甲基化和組蛋白甲基化來導致基因沉默。
- 分為兩組：小干擾
RNA small interfering RNAs,siRNA 和PIWI-interacting RNAs，piRNAs,其中siRNAs廣泛存在于動物植物真菌中，但是piRNAs只存在于后生動物中，在植物和真菌中不存在，在植物匯中由小RNA介導的DNA甲基化是小RNA參與到表觀遺傳主要的方式。
RdDM
In plants, the major siRNA-mediated epigenetic pathway is RNA-directed DNA methylation (RdDM), which is the subject of this Review. Initially detected in plants that were infected with RNA pathogens , RdDM was later shown to require siRNAs and core RNAi proteins.
RdDM通路是植物特有的，因為整個通路圍繞著兩個植物特有的與RNA聚合酶II相關的酶，分別是聚合酶IV和聚合酶V。
RNA pol IV 和Pol V詳細介紹
- DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學修飾。在植物中，DNA甲基化發生于CG，CHG和CHH序列。DNA甲基化在這些序列的建立都依賴于一條RNA介導的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation，RdDM)途徑。RNA聚合酶Pol IV和Pol V在RdDM途徑中分別負責產生小干擾RNA（small interfering RNAs，siRNAs）和長非編碼RNA（Long Intergenic Noncoding RNAs， IGN RNAs）。siRNA和AGO4結合并與IGN RNA互補配對，招募甲基轉移酶DRM2（Domain Rearranged Methyltransferase 2）至靶標位點建立DNA甲基化。
- Box1 RNA polymerases IV and V
RNA聚合酶有三大類： RNA聚合酶 I → 核糖體大亞基； RNA聚合酶 II → mRNA前體； RNA聚合酶III → tRNA和5S rRNA， Pol IV和Pol V與 Pol II 同源，是植物特有的，參與到RdDM。首先PolII PolIV和PolV均有12個亞基，大部分都是共有的，除了PolII的nuclear RNA polymerase B,NRPB; Pol IV的NRPD以及Pol V的NRPE。其中比較大的亞基是NRPD1和NRPE1，分別于NRPD2及NRPE2構成了催化核心，與polII 的NRPB1不同，在催化中心和碳末端CTDs存在保守氨基酸序列的代換和缺失，這可能就是他們參與到RdDM機制的原因，在NRPB1的CTDs區域有一段7肽重復，但是在NRPD1和NRPE1中這些重復是不存在的，在這些7肽重復中包含了一個基序（motif），這個基序通常出現在被稱作有缺陷的葉綠體和葉片的蛋白中DeCL,事實上，DeCL蛋白通常參與到rRNA的生理過程，但是NRPD1和NRPE1中的CTDs的功能未知。NRPE1中延長的CTD同時包含了Trp-Gly或者Gly-Trp的重復序列，這些重復序列是AGO蛋白的結合區域，可以和AGO4結合，而這個結構決定了Pol V參與到siRNA介導的從頭甲基化。
在Pol II中NRPB1和nRPB2亞基會結合NRPB5和NRPB9B會形成一個鉗型結構，在轉錄的時候可以抓住DNA，Pol V的NRPE5和NRPE9B的功能表明這或許是適應新的轉錄模板的特殊結構特征或者染色質修飾。在體外實驗中，Pol IV和PolV可以根據一個由RNA-DNA共同構成的模板來轉錄一個有RNA引物引發的轉錄本；此外，Pol IV還可以轉錄出一段RNA-RNA模板。盡管體外Pol IV和pol V的模板已知，但是一些有一些與他們傳統功能不同的，例如作為非常規的內切酶或者外切酶，或者是一個染色質外的模板應該被考慮。與Pol II相似，Pol IV和Pol V需要一些因子將他們從細胞質帶入細胞核中，酵母同源IWR1已經被證明可以將Pol II運輸到細胞核，在RdDM缺陷型突變體中，Pol IV 和Pol V的入核的方式與Pol II的方式相似。
過程簡述
首先由Pol IV 轉錄成長的雙鏈RNA（long dsRNAs），然后在DICER_LIKE3, (DCL3)作用下加工成siRNAs，然后輸出到細胞質中；接下來，這些siRNAs的一條鏈裝載到AGO4，然后再運回到細胞核，根據堿基互補配對原則這些siRNA會靶定Pol V轉錄的新生轉錄骨架上（nascent scaffold transcripts..真的布吉島怎么翻譯，但可以確定是一段非編碼RNA？）最終，這個復合體會招募DNA甲基轉移酶介導所有包含CG，CHG和CHH（H代表A，C或者T）序列位點的甲基化。最終結果會導致由Pol V轉錄的基因座上的轉錄本的沉默，特別是在轉座子位置或者DNA重復序列處。這種機制與裂殖酵母中的TGS截然相反.
裂殖酵母的TGS中的RNA Pol II 同時轉錄出siRNAs的前體和吸附siRNAs的支架RNA（scaffold RNA），然后再招募沉默感受復合體（silencing effector complex），與誘導DNA甲基化方面相比，這些沉默感受符合體通過對組蛋白3第9位上的賴氨酸進行甲基化（H3K9me）實現轉錄沉默和染色體異質化。通常發生在
pericentromeric repeats區域，或者一些發育調節基因developmentally regulated genes及逆轉座子retrotransposons部位。
Canonical RdDM pathway mechanisms
Pol IV dependent siRNA biogensis
Pol VI缺陷突變體證明超過90%的24nt-siRNAs來自Pol VI，而這些24nt-siRNAs會引起甲基化事件。
- Pol VI結合到TE和重復序列上的機制尚不完全清楚； 首先
SAWADEE HOMEODOMAIN HOMOLOGUE 1 (SHH1)會招募Pol VI， SHH會通過串聯的Tudor-like fold結合到甲基化的H3K9和沒有甲基化的H3K4。 - 盡管沒有在體內發現Pol IV的轉錄本，但是可以推斷出Pol IV可以在他的target基因座上轉錄出單鏈RNAs。該ssRNA會被
RNA-dependent RNA polymerase, RDR2復制形成dsRNAs。 -
The chromatin remodeller CLASSY 1 (CLSY1)也參與到該過程。 - DCL3（dicer）將合成的dsRNAs加工為24nt-siRNAs,然后經過3‘-OH的甲基化后裝載在
AGO4，該過程是由HEN1完成的。
Tips : AGO4還存在其他分支，比如部分冗余的AGO6，以及在再生組織中特異表達的AGO9
Pol V-mediated de novo methylation
- 三磷酸化的或者5'端被封住缺少poly（A）尾的Pol V的轉錄本被認為可以提供一個支架RNA和siRNAs互作，并且招募其他沉默因子。與Pol IV一樣，具體的機制尚不清楚，與之結合的DNA共有序列也沒有被發現；但很多ChIP-seq的結果顯示大部分Pol V被定位在胞嘧啶甲基化的轉座子和重復序列上，同時發現有24nt-siRNAs的存在。所以說明Pol V介導的RdDM應該發生在這些區域。
- Pol V 介導的RdDM通常發生在常染色質區域，特別是小的 “年輕” 的基因間區轉座子，或者存在于啟動子區域，外顯子，內含子區域的重復序列。RdDM靶標的位置與前面預測的PolIV PolV和PolII推測的一致，位于常染色質主要的基因轉錄區域。此外，Pol V在基因啟動子區域的富集也說明了它繼承了Pol II在基因上有的偏好性。
- RdDM似乎在某種程度上不會發生在富含大轉座子的近著絲粒端的異染色質區域。相反，該區域的修飾（H3K9me and DNA甲基化），更傾向于一種siRNA獨立的方式并且依賴于染色質重塑蛋白（chromatin remodeller DECREASED DNA METHYLATION1, DDM1）、DNA5端胞嘧啶甲基轉移酶（DNMT1），class enzyme 甲基轉移酶（MET1，也叫DMT1），還有植物特異甲基轉移酶（CMT2）和（CMT3）。
- SUVH2、SUVH9和SUVR2是SU（var）組蛋白甲基轉移酶家族的成員，它們有助于將Pol V招募到一些靶序列中。suvh2和suvh9不能催化組蛋白甲基化，但它們可以通過其SRA（SET and RING-associated）結構域與甲基化的DNA結合，從而有助于polV與染色質的相互作用平臺，染色質包含一些預先存在的甲基化。PolV的轉錄與染色體的結合是在DDR復合體協助下完成的。DDR復合體的成員:CLSY1-related putative chromatin remodeller DEFECTIVE IN RNA_DIRCTED DNA METHYLATION1(DRD1);DEFECTIVE IN MERISTEM SILENCING3（DMS3），DMS3是一個維持染色體構像的鉸鏈蛋白；還有一個在RdDM通路中起到多種作用的小的植物特異蛋白：RNA-DIRCTED DNA METHYLATION1（RDM1）。
- Pol V 與NRPE1互作來招募AGO4蛋白，他們都含有AGO hook motif，這個基序就是與AGO。PolV的motif位于C-端特殊的大亞基上，KTF1則是一個疑似的包含AGO hook motif的延伸因子。在Pol V介導的轉錄中，結合在AGO4上的siRNA會和PolV新轉錄的轉錄本根據堿基互補配對結合，然后招募結構重排甲基轉移酶2（DRM2）進而對基因組同源區域的DNA進行從頭甲基化，RDM1在招募DRM2的過程中起到關鍵作用，因為它是唯一一個被證明和AGO4和DRM2都能互作的蛋白，同時他還可以結合單鏈DNA。RDM1在RdDM機制中可能還會扮演更多的角色。
- INVOLVED IN DE NOVO2（IDN2）
IDN2是一個雙鏈RNA結合蛋白，和SUPPRESSOR OF GENE SILENCING 3，SGS3有關，同時IDN2與PTGS也有關。 IDN2可以和兩個冗余的旁系同源產物（redundant paralogues）IDP1和IDP2形成復合體。IDN2-IDP復合體可以穩定siRNAs和PolV支架RNAs結合的穩定性，同時還可以通過和SWI/SNF染色質重塑復合體的互作來改變核小體定位，從而加速RdDM機制的完成。
Interplay with chromatin features
組蛋白修飾
大約70%的RdDM的target幾乎都被H3K9me修飾過，這樣可以形成一個DNA甲基化的反饋循環來加強基因沉默,比如SUVH4（kryptonite）SUVH5和SUVH6催化H3K9me，與CMT3催化的非CG-甲基化緊密相關，然而CMT3在染色體上結合的位點是H3K9me，因此建立一個自我加強的loop可以長期保持表觀修飾。
一些RdDM的target需要一些可以去除激活標記的組蛋白修飾酶來維持DNA甲基化和促進H3K9的甲基化，這些激活標記包括乙酰化，H3K4me和H2B泛素化等。HDA6與MET1結合來維持CG甲基化并且通過乙酰化組蛋白來維持H3K9me。Jumonji C-type histone demethylase JUMONJI14（JMJ14）脫甲基酶以及兩個相關的組蛋白脫甲基酶LYSINE-SPECIFIC HISTONE DEMETHYLASE 1(LDL1)和LDL2一起維持DRM2指導的DNA甲基化，可能是通過去除靶標位置的H3K4me。對于非CG甲基化及靶標位置H3K9me的維持需要H2B的去泛素化。
高階染色質結構
首先兩個MORC-型ATPases在RdDM通路中起到重要作用，在擬南芥中，MORC6作為ATPase將DMS3變為SMCHD1，這個蛋白是個cohesin-like蛋白，在大鼠中會導致X染色體的去激活。MORC1和MORC6缺失植物突變體表現出輕微的DNA甲基化和組蛋白修飾抑制盡管在靶標位點失去了對轉錄組的沉默，這表明他們的作用應該是導致染色質凝結，有研究支持了這個說法，一項研究表明這些突變體在著絲粒周圍的異染色質表現出去凝結化。
