??最近一直忙期末匯報和腳本編寫，沒來的及接著往下寫文章，年前把這一塊寫了，然后再往下的分析流程就比較特異性了，做一步寫一步那種，相對于這種已經常規化的流程（除了一些細節上的差異，別的都是大同小異的了），再往下的可能就不是很常規的分析手段了，不同的實驗室有不同的分析方法，希望能夠有大佬提點意見，多多交流。
“突變”區別
??對于WGS的數據，在處理完bam文件以后，就是call variations了，之后所有的工作其實都是針對variations進行分析，那么說到變異呢，其實中文的“變異”在英文里對應多個單詞，經常看到傻傻分不清，這里稍微區別一下。
??mutation：核苷酸序列的永久性改變（來源于ACMG），在人群中小于1%或5%（來源于北大生物信息學公開課）
??polymorphism：在人群中頻率超過1%（來源于ACMG），或超過5%（來源于北大生物信息學公開課）
??variation/variant：以上兩個的總和（來源于北大生物信息學公開課）
變異類型
??我們一般所說的variations主要有四大類：SNV，INDEL，SV，CNV。
????SNV即單核苷酸位點變異（single nucleotide variants）
????INDEL即小片段插入缺失（insertion and deletion）
????SV即結構變異（structural variation）
????CNV即拷貝數變異（copy number variation）
SNV與SNP
??說到SNV，可能大家也經常看到SNP（single nucleotide polymorphism），同樣是混淆使用，這倆其實還是有一些區別的，看到上面對變異的區分，其實也能看出這倆的區別來：
??一般SNP是二態的，SNV沒有這樣的限制，如果在一個物種中該單堿基變異的頻率達到一定水平（1%）就叫SNP，而頻率未知（比如僅僅在一個個體中發現）就叫SNV，SNV包含SNP。
變異簡述
??人基因組通常有4.1~5.0M的變異，但是99.9%都是由SNV和short indel造成。
??通常，一個人全基因組內會有約 3.6~4.4 M 個 SNVs，絕大數（大于 95%）的高頻（群體中等位基因頻率大于 5%）的 SNP 在 dbSNP中有記錄，高頻的SNP一般都不是致病的主要突變位點。
??通常，一個人全基因組內會有約 600K 的 Indel（<50bp的插入缺失為small indel）。
??編碼區或剪接位點處發生的插入缺失都可能會改變蛋白的翻譯。
SV
??結構變異指的是在基因組上一些大的結構性的變異，比如大片段丟失（deletion）、大片段插入（insertion）、大片段重復（duplication）、拷貝數變異（copy number variants）、倒位（inversion）、易位（translocation）。一般來說，結構變異涉及的序列長度在1kb到3Mb之間。結構變異普遍存在于人類基因組中，是個人差異和一些疾病易感性的來源。結構變異還可能導致融合基因的發生，一些癌癥已經證實和結構變異導致的基因融合事件有關。
CNV
??拷貝數變異指的是基因組上大片段序列拷貝數的增加或者減少，可分為缺失（deletion）和重復(duplication)兩種類型，是一種重要的分子機制。CNV能夠導致孟德爾遺傳病與罕見疾病, 同時與包括癌癥在內的復雜疾病相關，因此對于染色體水平的缺失、擴增的研究已經成為疾病研究熱點。
以上數據在不同的數據庫或文獻上可能有所差異，但相去不遠，具體的變異分類以及分布就不詳述，可參考一些文獻，下面說說怎么進行其中的SNV和indel的檢測。
??以下我將提供兩種分析方式的腳本（DeepVariant以及bcftools）和流程，為啥沒有GATK？因為我覺得黃老師的這篇GATK分析流程寫得已經很好了，大家可以參考一下。
Bcftools
??與舊版的samtools+bcftools不同，作者為了避免bcftools和samtools的版本不同導致的不兼容，新版的bcftools可以自己完成call snv/indel的工作。
??使用bcftools進行變異檢測，一般分為三部曲，分別為三個模塊mpileup、call、filter，當然，我們一般也不會分三步進行操作，而是使用管道（pipeline）進行編寫腳本，這樣能減少產生一些不必要的過程文件，同時提高自動化和效率，下面是我的實際使用腳本。
$ bcftools mpileup --threads 12 -q 20 -Q 20 -Ou -f /your/path/of/reference /your/bamfile/after/sorted.merged.markdup | bcftools call --threads 12 -vm -Ov | bcftools filter --threads 12 -s FILTER -g 10 -G 10 -i "%QUAL>20 && DP>6 && MQ>50 && (DP4[2]+DP4[3])>4" > raw.tmp.vcf
## bcftools mpileup檢測變異;
# --threads線程數
# -q表示reads比對質量選擇，MAPQ，默認0;
# -Q表示reads堿基對質量選擇，默認13
# -O表示輸出格式,u表示未壓縮bcf格式;
# -f參考序列位置
## bcftools call參數
# --threads線程;
# -v只輸出變異位點;
# m為克服-c調用模型中已知的局限性(與-c沖突)而設計的多等位和罕見變異調用的替代模型;
# -O輸出文件格式v未壓縮vcf;
## bcftools filter篩選變異;-i只保留后面條件的;-s對不符合的變異打上標簽
$ awk -F "\t" '{if($1~/#/){print}else if($7~/PASS/){print}}' raw.tmp.vcf > var.flt.vcf
# 將標為低質量的變異去掉
??有幾個點值得討論一下，首先是mpileup的-q參數，這個和之前提到的samtools view的-q是一樣的，前面的文章有大篇幅說過這個MAPQ的數值，20翻譯過來的意思其實就是比對正確率99%。
??filter中的-s是軟過濾的意思，就是把不符合后面條件的variations打上標簽，但不過濾掉；-g，-G這對參數是說，indel附近的indel或snp是不準確的，大多是假陽性，過濾掉，這里我設的10bp，這個值還是比較合理的；-i是保留后面符合條件的變異，剛好和-e相反，兩者選其一，我這里用的-i編寫過濾表達式
????QUAL：基于Phred格式的表示ALT的質量，也可以理解為可靠性；可以理解為所call出來的變異位點的質量值。Q=-10lgP，Q表示質量值；P表示這個位點發生錯誤的概率。因此，如果想把錯誤率從控制在90%以上，P的閾值就是1/10，那lg（1/10）=-1，Q=（-10）*（-1）=10。同理，當Q=20時，錯誤率就控制在了0.01。這個參數其實和mpileup的-Q是重復的。
????DP是堿基的覆蓋深度，一般很多公司和課題組會選擇10，但我這里選擇的是6，本著寬進嚴出的原則，保留更多的陽性variations，10也是沒有關系的。
????參考上一篇里的MAPQ分布可以看到，使用bwa mem后，其實大多數的reads的MAPQ都在60，這樣的話，MQ最好也就是60，但是在40有一個小突起，對于MQ的篩選，大家的選擇可以酌情而定，50是一個大家使用較多的閾值點。
????DP4分別是正反鏈上REF和ALT的深度，我用“DP4[2]+DP4[3]>4”篩選ALT的深度至少是5的variations。
??那么，以上的腳本其實是符合單個樣本進行分析的，但如果是家系樣本進行分析，其實是有問題的，因為在call這一步的時候用-v參數只輸出變異位點，在獲得了三個人的vcf文件進行merge的時候，對于一些變異（這些變異只存在于三個人的某一個或某兩個），你就不知道不存在的那個人身上，是因為無變異還是沒有覆蓋到reads。這不利于做trio分析。那么要克服這個問題只需要去掉-v參數即可。
??然后進行merge，是在完成了一個家系的call snp/indel以后。
$ bgzip -c -f -@ 12 var.flt.vcf > var.vcf.gz
# 進行文件壓縮;-c不改變內容; -f強制輸出，存在就覆蓋;-@線程數
$ bcftools index -t var.vcf.gz
# 建立索引，merge需要; -t建立tbi格式索引
$ bcftools merge -Ov --force-samples -l file.list -o merge.var.vcf
# 進行合成，-O輸出文件格式,v表示vcf格式文件;
# --force-samples，對于重名樣本強制合成;-o輸出文件
# -l包含文件名的文件，一行一個文件名，將先證者放在第一位
??之后可以用bcftools對結果做一下統計處理
## 統計結果plot-vcfstats
$ bcftools stats -F/your/path/of/reference -s - merge.var.vcf > merge.var.vcf.stats && \
$ plot-vcfstats merge.var.vcf.stats -p vars_output
# plot-vcfstats程序在bcftools下的misc目錄中
DeepVariant
??谷歌提供了分別適用于WGS和WES的腳本，可供大家參考。我親測了一下這個軟件，速度有點慢……完全沒有谷歌自己描述的那么快，做為嘗鮮吧，把當時的腳本放上來，這里要特別感謝師姐的指導！雖然最后我也沒打算用這個軟件完成我的課題吧。
????https://github.com/google/deepvariant/tree/r0.7/scripts
??Deepvariant無需安裝，直接拉docker下來就行，不然要是安裝，這個環境配置怕是要折磨死人的。
# docker安裝，僅針對ubuntu用戶
$ sudo apt-get install apt-transport-https ca-certificates curl software-properties-common
$ curl -fsSL https://download.docker.com/linux/ubuntu/gpg | sudo apt-key add -
$ sudo apt-key fingerprint 0EBFCD88
$ sudo add-apt-repository "deb [arch=amd64] https://download.docker.com/linux/ubuntu $(lsb_release -cs) stable"
$ sudo apt-get update
$ sudo apt-get install docker-ce
$ sudo docker run hello-world
$ sudo usermod -aG docker $USER
??拉取一下docker就可以使用deepvariant了
$ sudo docker pull dajunluo/deepvariant
$ sudo docker images
$ sudo docker run -it dajunluo/deepvariant:latest
$ sudo docker run -it --name deepvariant -v /you/path/of/refrence/dir/:/home/ref_hg19 -v /home/biowork/:/home/biowork dajunluo/deepvariant
# -v是把我本地的數據對接到docker環境里，這個請自行根據需要對接
$ nohup python /home/bin/make_examples.zip --mode calling --ref /you/path/of/refrence --reads //you/path/of/bam --examples example.gz > 1.log &
$ nohup python /home/bin/call_variants.zip --outfile call_variants_output.gz --examples example.gz --checkpoint /home/models/model.ckpt > 2.log &
$ nohup python /home/bin/postprocess_variants.zip --ref /you/path/of/refrence --infile call_variants_output.gz --outfile output.vcf.gz > 3.log &
??之后便可以用bcftools或者gatk進行merge，對于這一步可以參考上面的gatk鏈接或者bcftools步驟。
??到了這一步就可以完了么？顯然不是，你用上述兩個方法或者參考黃老師的腳本用gatk得到的結果，如果你仔細看，就會發現。
??這是什么鬼，這又是什么鬼，為什么有那么多的多等位位點，你要是去統計，會發現這樣的多等位位點還挺多的，所以你還不能直接過濾。對于這些變異我們一般是不會考慮嵌合的，因為平均30X的WGS是沒法檢測出嵌合體的。那么對于這樣的位點怎么去考慮分析呢？
??比較便捷的方法就是用bcftools里面的norm工具了。
$ bgzip -c -f -@ 12 merge.var.vcf > merge.var.vcf.gz
# 進行文件壓縮;-c不改變內容; -f強制輸出，存在就覆蓋;-@線程數
$ bcftools index -t merge.var.vcf.gz
# 建立索引, -t建立tbi格式索引
$ bcftools norm -Ov -m-any -f /you/path/of/refrence merge.var.vcf.gz > norm.vcf
??這樣，多等位位點就變成了二等位位點了，便于后續的分析。今天的內容就到這里了，下一篇就是注釋以及各種過濾了。
??水平有限，要是存在什么錯誤請評論指出！請大家多多批評指正，相互交流，共同成長，謝謝！！！
