單細胞測序技術將徹底改變整個生物科學
Single-cell sequencing-based?technologies will revolutionize ?whole-organism science
全文鏈接： https://www.nature.com/articles/nrg3542
核心觀點
DNA測序技術的發展使得能夠分析單細胞的基因組和轉錄組，并且很快將實現單細胞表觀基因組學和蛋白質組學分析。
單細胞基因組分析可揭示單個細胞之間的基因組變異性，并用于以譜系樹的形式重建細胞祖先。
單細胞轉錄組分析可用于研究單個細胞的功能狀態并以無偏差的方式推斷和發現細胞類型。
基于高通量測序整合單細胞分析，將能夠同時分析細胞的基因組，轉錄組學和表觀基因組。這些數據將揭示細胞的類型及其祖細胞，并以它們的當前功能狀態，推斷它們的祖細胞的類型和功能狀態。
單細胞綜合分析，將揭示生物學和醫學的基本問題，包括癌癥起源和發生，人類細胞類型的數量和關系，以及再生組織中細胞更新的速率和結構。
Methods for single-cell isolation-單個細胞的分選方法
生物體有成千上萬種細胞類型，有多種方法可以從生物體組織中分離出單個的細胞。（主要分為隨機和靶向分離兩種）
號外：分離細胞是單細胞研究中最困難的步驟之一。目前的單細胞分離策略主要分為三類：手動分離、熒光激活的細胞分選和微流體技術。在進行單細胞轉錄分析之前，我們需要確定自己拿到了正確的細胞。如果你想要的細胞已經處于懸浮狀態（比如循環腫瘤細胞），而且含量相對比較豐富，那么流式細胞分析將是你的理想選擇。如果樣本是實體組織，我們可以用酶分解掉膠原和其他細胞外蛋白。不過酶學消化對細胞影響較大，甚至可能改變基因轉錄情況。把組織細胞制成懸液之后，我們就可以通過特異性的熒光標簽分離出自己想要的細胞。進一步拿到單細胞是比較棘手的一步，可能需要用到微流體設備。將細胞分散到懸液中，會失去它們在組織里的位置信息。如果你想要了解單細胞所處的環境，就得使用激光捕獲顯微切割技術。這種技術通過掃描組織切片定位目的細胞，并將其提取出來。操作者需要非常小心，以免切到細胞或細胞核。數量最為稀少的細胞只能用毛細管等器具手動獲取。
從實體組織中分離單個細胞關鍵兩步：
第一步，（單個細胞）通常是用酶解的方式把離體或者活體分解成單個的細胞；
第二步，單個的細胞必須在單個的反應器中進行裂解和進一步的分析。
四種方式獲得單個細胞及其優缺點（Table 1）： ?
顯微操縱（精密控制）（micromanipulation）
熒光激活的流式分選：flow sorting?using fluorescence-activated cell sorting (FACS)
激光捕獲顯微切割（Laser Capture Microdissection，LCM）
http://www.tj3zx.cn/system/2016/06/27/012259863.shtml
微流體技術（microfluidic?device）
Single-cell genomics
Reconstructing cell lineage trees using somatic mutations.?
基于體細胞突變重建細胞譜系圖。
最初，人們認為同一個個體不同的細胞具有完全相同的基因組的觀點證明是錯誤的。體細胞分裂時DNA的復制不可能絕對精確無誤-引起體細胞突變。體細胞突變從受精卵階段開始積累，這些突變具有很高的幾率賦予我們身體中的每個細胞具有獨特的基因組特征。體細胞獨特的基因組信號可以構建精度很高的細胞譜系。人類生物學和醫學中尚未解決的核心問題實際上是關于人類細胞譜系樹的問題：它在發育，生長，更新，衰老和疾病中的結構，動力學和變異性。完全了解每個細胞中積累的獨特體細胞突變將允許我們以極高的精度重建細胞譜系樹。
Cell lineage reconstruction of cancer will elucidate its development.?
癌細胞譜系重建將闡明其發展過程
細胞譜系重建癌癥將闡明其發展。癌癥患者通常不會死于腫瘤的發生，而是死于癌癥轉移。然而，盡管進行了數十年的研究，關于轉移灶起源于何處的關鍵問題尚未得到徹底的闡述（圖2）。轉移癌細胞的來源癌癥病灶中的任何一個細胞還是來自于不腫瘤亞克隆？或是來自于腫瘤干細胞？或者是轉移來自腫瘤細胞和正常移動的巨噬細胞融合形成的雜合體？化療后癌癥復發的原因，可能是普通腫瘤細胞隨機逃避化療引起的？癌細胞譜系對解答這些問題至關重要。
早期的實驗分析了每個細胞中的幾個關鍵標記。在最近的一個例子中，通過熒光原位雜交（FISH）測定單個細胞中多達8個染色體畸變及其組合的發生率，來研究了急性淋巴母細胞白血病的異質性和腫瘤起源。這使得在癌癥進展過程中可以分析亞克隆結構。最近，使用數百個單核的測序產生個體乳腺癌細胞的近似拷貝數分布，從而重建腫瘤群體結構和進化歷史。在另一項研究中，對患有骨髓增生性腫瘤的患者的全外顯子組進行單細胞測序，以重建腫瘤祖細胞并識別出候選驅動突變。
使用二代測序構建的體細胞突變譜系示蹤，已經在體內大量細胞群體中得到了證實，但對于單個細胞尚無報道。且bulk測序不能顯示，關于突變或畸變的不同組合的準確信息，解決此類問題有待構建癌細胞的單細胞譜系分析
通向單細胞基因組學的道路。
雖然，現在對細胞群體的DNA進行測序已經變得很容易，但對來自單細胞的DNA進行測序仍然是一個挑戰。盡管最近通量有所提高，獲得足夠深度的多個單細胞測序分析的成本仍然很高，這已經成為限制大規模應用單細胞基因組學，轉錄組學和表觀基因組學的阻力。
Single-cell transcriptomics
單細胞轉錄組學
The molecular state of cell populations
細胞群的分子狀態
給定異質細胞群，測量關鍵因子的平均值，例如基因型，RNA輸出或目標基因座的表觀遺傳狀態，僅提供系統狀態的部分表征。不幸的是，用于量化細胞群的分子狀態的大多數方法，從轉錄分析到蛋白質組學，是基于通過平均單個細胞的信號來估計數百萬個細胞的集合中的平均行為。例如，不可能基于微陣列或RNA測序（RNA-seq）數據確定基因表達的細胞間差異，或確定信號蛋白的中間水平是否是雙峰或均勻種群內的結果。基于標準蛋白質組學的分布。超越基于平均值的細胞群表征需要在不同尺度上平衡采樣細胞的數量和功能覆蓋的完整性（表2）。
Applications of single-cell transcriptomics.
單細胞轉錄組的應用
單細胞轉錄組學的應用。單細胞轉錄組學的一個主要應用是分析稀有細胞類型。例如，可以從患者血液中獲得循環腫瘤細胞，但是通常每個血液樣品僅分離少量細胞，并且這些細胞通常會被更多數量的正常細胞污染。單細胞RNA-seq可用于區分這些細胞類型，同時從腫瘤中獲得表達數據。類似地，根據定義，早期人類胚胎僅包含稀有細胞類型，其僅存在于瞬時。關于早期發展的關鍵問題可以使用轉錄組學來解決。在這種情況下，轉錄組學具有能夠使用序列多態性（例如，SNP）來區分衍生自兩個親本基因組中的每一個的轉錄物的優點。另一個將從單細胞轉錄組學中獲益的領域是成體干細胞的研究，這種干細胞通常很少見，有時只是短暫存在，并且可以與其他細胞類型混合。然而，通過使用單細胞RNA-seq，可以簡單地通過從組織中取無偏倚的細胞樣品來廣泛地采樣每種細胞類型。單個細胞的大小，形態，發育起源和功能特性差別很大。然而，盡管在某些特定情況下取得了進展，但我們目前對細胞類型，其起源，進化和多樣性的理解程度。
The road to single-cell transcriptomics.
單細胞轉錄組學之路
通往單細胞轉錄組學的道路。盡管單分子DNA72,73,74和RNA92測序取得了進展，但尚不可能直接從單細胞中測序RNA。目前，RNA需要轉化為cDNA并進行擴增，這必須以最小的損失實現，并且不會引入太多的定量偏差。
在單細胞轉錄組實驗中存在幾種噪聲源。全局（即，影響細胞中RNA的總量）和局部（例如由于共調節或大規模染色質修飾）存在生物學波動。還存在技術噪音，例如由于移液誤差，溫度差異，測序深度的差異，PCR擴增偏差和逆轉錄效率的差異。重要的是要認識到單細胞轉錄組分析也是單分子分析，因為許多基因僅在每個細胞的少數mRNA分子中表達。
Single-cell epigenomics and proteomics
單細胞表觀組和蛋白組
顯然，細胞的基因組和轉錄組僅捕獲其部分狀態，并且細胞的大部分功能由其表觀基因組和蛋白質組決定，這增加了群體中細胞的多樣性。單細胞轉錄組學的另一個應用領域是轉錄波動的表征。 RNA含量的動態變化與循環過程相關，例如細胞分裂和晝夜節律的細胞周期。其他波動是隨機的，反映了轉錄是由許多概率步驟組成的離散過程的事實。通過細胞分裂時細胞內容的不均勻分配引入了進一步的異質性。大量單細胞的直接轉錄組分析應該開啟對未受干擾的細胞群中振蕩和隨機調節過程的研究。在假定相同的細胞群中，可以鑒定多組共同調節的基因。每組必須是功能過程的一部分，例如振蕩器或隨機過程。
conclusion
結論
單細胞是生命的基本單位。因此，單細胞分析不僅僅是更進一步地邁向更敏感檢測，而且是對生物學更基本原理理解質的飛躍。在這里，我們描述了基于單細胞測序分析的最新進展。這些進展包括單個細胞的基因組和轉錄組測序，我們預測很快就可以在數千甚至數百萬個細胞中的核酸完成全基因組測序。此外，我們也描述了如何將細胞現象轉換為基于DNA序列的讀數。例如，可以通過ChIP-seq將諸如組蛋白修飾的表觀基因組標記轉化為DNA信號。類似地，蛋白質修飾和相互作用可通過鄰近連接測定法轉化為DNA信號。
DNA測序的海量信息及其不斷增長的勢頭，意味著許多不同的細胞現象可轉化為DNA讀出。這種融合的結果應該允許多種模態的綜合測量。這種整合的可行性已經在基因組學和轉錄組學分析中得到證實，并且同時分析單細胞中的DNA，RNA和蛋白質可用于定量描述分子生物學的中心法則。盡管單細胞分析方法正在快速發展，但在單細胞整合分析中同時分析多種特性仍待開發。細胞特性之間的生化差異導致分析它們的方法需要改變。并有待開發通用性的單細胞多特性分析測量。這種整合單細胞遺傳，表觀遺傳，轉錄和蛋白質組學的分析方法（圖1），將允許構建多個分子標記之間的關系，無偏見的識別復雜細胞群結構，直接或間接表征其之間的因果關系。開發復雜的單細胞遺傳分析方法可以更好地理解這些細胞特性，并重新定義“細胞類型”的概念。這種整合的可行性已經在基因組學和轉錄組學分析中得到證實。
最后，在發育過程中單個細胞的突變的積累，可以用于推斷每個細胞的祖細胞。雖然細胞命運圖描述了特定狀態下細胞的下一潛在狀態，但并不能獲得它們的精確譜系關系。相比之下，使用體細胞突變重建細胞譜系樹，不但能獲得細胞間的譜系關系，還可以提供它們祖細胞的狀態信息。我們預計，對單細胞進行的綜合分析將為推動小鼠和人類等高等生物研究發展提供動力。如果采樣細胞的狀態 - 由它們的轉錄組和表觀基因組決定，并且可由它們的蛋白質組進一步增強 - 構成重建細胞譜系樹的葉子，那么可以精確的知道，其祖細胞的狀態；由譜系樹內部節點可以形式化為數學模型。這將允許擴展重建范圍來描述其狀態改變的動態，并將細胞譜系樹與細胞命運整合在一起。
高等生物的細胞譜系樹可以回答人類生物學與醫學中的許多開放性問題，并且有可能將醫學轉變為個性化的診斷和治療。大約十年前，就有人提出，單細胞基因組學的發展可能會開啟“人類細胞譜系項目”，并以重建整個人類細胞譜系樹為目的。我們相信，對單細胞測序技術的回顧和發展將是我們更接近使實現這一目標，并將徹底改變整個有機體科學。
