生信小課堂
影響因子：8.44
關于非腫瘤生信，我們也解讀過很多，主要有以下類型
1 單個疾病WGCNA+PPI分析篩選hub基因。
2 單個疾病結合免疫浸潤，鐵死亡，自噬等基因集，機器學習算法等。
3 兩種相關疾病聯合分析，包括非腫瘤結合非腫瘤，非腫瘤結合腫瘤或者非腫瘤結合泛癌分析
4 基于分型的非腫瘤生信分析
目前非腫瘤生信發文的門檻較低，有需要的朋友歡迎交流
研究背景：
冠狀動脈疾病(CAD)仍是全球主要死亡原因之一。動脈粥樣硬化病變通常導致進行性冠脈狹窄、心肌缺血、壞死，最終累積急性心血管綜合征(ACS)的風險。外周生物標記物是監測冠狀動脈疾病(CAD)進展的越來越重要的非侵入性方法。近年來的證據表明，免疫紊亂在CAD病理過程的啟動和發展中起著決定性作用。
研究結果：
一、外周血中差異mRNA表達的鑒別
1、本研究中一共有199例CAD患者和218例對照組的外周血轉錄組。PCA分析GSE20680，GSE20681 和GSE42148表明，批次效應在三個基因集中已被去除（圖2A，B）。
2、共鑒定出762個DEGs，其中上調基因396個，下調基因366個(圖2C)。
3、熱圖顯示CAD患者與對照組之間的前17 DEGs，提示其可能參與CAD的病理過程（圖2D）。
二、DEGs的功能富集分析
1、蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡說明了蛋白質水平上的交互關系（圖3A）.
2、GO分析顯示DEGs涉及的分子功能，生物過程和細胞成分（圖3B）。
3、KEGG通路富集分析顯示，DEGs集中于5種與免疫相關的信號通路，其中以細胞因子與細胞因子受體相互作用的信號通路最多（圖3C）。
三、DE-IRGs測定和免疫相關細胞圖譜分析
1、韋恩圖（Venn）顯示，上述CAD患者的DEGs與IRGs中，交集到58個DE-IRGs（圖 4A）。
2、熱圖顯示，主要有28種免疫細胞發生改變（圖4B），箱式圖顯示CAD患者和對照組間，免疫細胞富集分數的差異（圖4C）。其中，活化的樹突狀細胞、肥大細胞、中性粒細胞、Th17細胞和MDSC在CAD中的比例增加，活化的B細胞和CD56細胞的比例減少。
3、氣泡圖顯示，發生改變的28中免疫細胞存在相關性（圖4D）。例如，活化的CD4+ T細胞和Th2細胞具有相關性（r=0.55），中性粒細胞和血漿樹突細胞具有相關性（r=0.62）。
四、CAD中14個關鍵外周DE-IRGs的鑒定及免疫診斷模型的構建
1、通過LASSO回歸分析，最終確定14個基因，構建CAD診斷模型（圖5A、B）。
2、利用ROC曲線評價14個基因的診斷效果（圖5C、D），其中14個基因ROC曲線下面積：CCR9 (AUC=0.686), CER1 (AUC=0.604), CSF2 (AUC=0.688), CXCL2 (AUC=0.589), HTR3C (AUC=0.699), IL13RA1 (AUC=0.650), IL1A (AUC=0.667), INSL5 (AUC=0.624), MBL2 (AUC=0.619), MMP9 (AUC=0.649), MSR1(AUC=0.679), NR4RA2(AUC = 0.657), NTS(AUC = 0.667) and TNFRSF19 (AUC=0.686)。
3、ROC曲線分析上述14個基因的診斷模型訓練集（圖5E、F），當14個基因都包含在一個診斷模型中時，訓練數據集和測試數據集的AUC分別為0.968和0.859。
五、CAD患者外周血免疫特性分析
1、箱式圖顯示，外周血中所鑒定的mRNA中，14個關鍵外周DE-IRGs在CAD組與對照組之間有顯著差異（圖6A）。其中, CCR9, CER1, CSF2, IL13RA1, INSL5, MBL2, MMP9, MSR1, NTS 和TNFRSF19基因上調表達, 而CXCL2, HTR3C, IL1A,和NR4A2基因表達下調。
2、氣泡圖顯示，這些基因大多數具有正相關的關系（圖6B）。
3、多種免疫成分在CAD診斷和病理機制中的重要作用，熱圖顯示了14個CAD中DE-IRGs和28種免疫細胞相關性，以此分析免疫成分與冠心病之間的相互關系（圖6C）。
六、在體內驗證10個候選DE - IRGs與CAD的相關性
1、小鼠主動脈弓油紅O染色顯示，20周小鼠主動脈弓內大量脂質斑塊聚集，導致管腔狹窄（圖7）。
2、對于體重發現，CAD模型組平均體重明顯高于對照組（圖7B）。
3、CAD組外周循環低密度脂蛋白(LDL)和甘油三酯(TRIG)水平升高（圖7C、D）。
4、全血總mRNA檢測結果顯示，CAD模型組CCR9、CSF2、IL13RA1、NTS表達明顯高于對照組（圖7E-H、M）。
5、但是IL1A，在模型組中也有升高，與預測數據結果相反（圖7I）。
6、然而，CXCL2、INSL5、MSR1、NR4A2和TNFRSF19在CAD模型組和對照組間無差異 (圖7G，J-L，N)。
七、IL13RA1激活JAK1/STAT3通路，調節CAD中巨噬細胞功能
1、細胞實驗中，ox-LDL處理使BMDMs中IL13RA1 mRNA的表達增加，并且激活了JAK1/STAT3信號通路，而且使VEGF-C的產生增加（圖8A，B-E）。
2、動物實驗中，在HFD飲食誘導的20周齡LDL缺失小鼠(CAD小鼠模型)的主動脈中，IL13RA1 mRNA表達、p-JAK1、p-STAT3、VEGF-C和IL-6蛋白水平升高(圖8C，D-F)。
3、免疫熒光圖可見轉染siRNA的RAW264.7細胞中有良好的轉染效果(圖8G)， IL13RA1 mRNA表達被顯著減少 (圖8H)，并且磷酸化的JAK1和STAT3、VEGFC、TGF-β和αSMA的表達水平降低 (圖8I，J)。
4、IL13RA1敲除組中SCARB1和ox-LDL處理組的CD36 mRNA表達水平降低（圖8M、N）。然而，IL13RA1敲除卻增加了IL-6的表達量 (圖8I，J)。
5、油紅O染色結果顯示IL13RA1敲除組巨噬細胞吸收的脂滴減少（圖8K，L）。
研究總結：在該研究中，作者利用數據庫中篩選的14個關鍵性的差異表達免疫相關基因(DE -IRGs)的基礎上，構建了晚期CAD診斷模型。然后，作者使用低密度蛋白受體缺陷小鼠(典型的CAD動物模型)來確定候選基因與CAD的相關性，其中IL13RA1可能通過調節JAK1/STAT3通路參與動脈粥樣硬化的炎癥、纖維化和膽固醇分泌過程。
