摘要

背景

Wilson病（WD）是由編碼銅轉運蛋白的ATP7B突變引起的常染色體隱性遺傳疾病。隨后的銅積累導致涉及肝，神經和精神癥狀的可變WD臨床表型，沒有明確的基因型 - 表型相關性。本研究的目的是分析來自WD患者的肝臟和血液中全基因組水平的DNA甲基化改變，以研究與WD診斷和表型相關的表觀基因組改變。我們使用全基因組亞硫酸氫鹽測序（WGBS）來檢查WD受試者的不同群組，以確定DNA甲基化是否可以區分患者與健康受試者和患有其他肝臟疾病的受試者并區分不同的WD表型。

結果

肝臟中的WGBS分析鑒定了969個高甲基化區域和871個低甲基化差異甲基化區域（DMR），特異性識別WD患者，包括具有全基因組顯著性的18個區域。WD特異性肝臟DMR與富含葉酸和脂質代謝功能以及急性炎癥反應的基因相關，并且可以區分WD患者的早期纖維化。功能注釋顯示WD-高甲基化肝臟DMR富含肝臟特異性增強子，側翼活性肝臟啟動子和肝臟發育轉錄因子的結合位點，包括肝細胞核因子4α（HNF4A），維甲酸X受體α（RXRA），Forkhead方框A1（FOXA1）和FOXA2。還鑒定了與WD發育相關的DMR，包括具有全基因組顯著性的15個。然而，肝臟中的WD DMR與肝細胞類型比例的大規模變化無關。在血液分化的WD患者中檢測到來自健康和疾病對照受試者的DMR，并區分具有肝和神經性WD表現的患者。WD表型DMR對應于富含精神衰退，異常B細胞生理學功能的基因，以及作為多梳抑制復合物1（PRC1）的成員。在小驗證隊列中測試的與WD表型相關的44個DMR具有0.9的預測值。

結論

我們確定了WD的疾病機制相關的表觀基因組特征，揭示了對這種復雜的單基因疾病的潛在生物標志物和治療方法的新見解。

電子輔助材料

關鍵詞：Wilson病，表觀遺傳學，銅，DNA甲基化，全基因組亞硫酸氫鹽測序，染色質，肝臟，血液，生物標志物，增強子

背景

Wilson病（WD）是一種常染色體隱性疾病，由銅的積聚主要在肝臟和大腦中引起，這是由于突變影響銅轉運基因，ATPase銅轉運β（ATP7B）。在健康個體中，ATP7B有助于銅販賣肝細胞內和所需的銅排泄到膽道[ 1，2 ]。然而，雖然現在更好地理解遺傳基礎，但由于對深層致病機制的不完全理解，缺乏金標準診斷測試以及最終有限的治療選擇，WD仍然代表臨床上具有挑戰性且往往未被認識的病癥 [3]]。臨床表現包括肝臟，神經和精神病表現。DNA序列突變與臨床表現之間缺乏明確的相關性可歸因于超過500種突變的存在，這些突變共同損害ATP7B銅轉運蛋白活性，并且可能存在伴隨的修飾基因。最引人注目的證據表明，遺傳突變因素不談影響表型從描述受WD單卵雙生子但呈現不同的表型[多個病例報告衍生4，5 ]。

DNA甲基化是一種可逆的表觀遺傳修飾，受遺傳和非遺傳因素如營養和毒素暴露的影響，并作用于遺傳和環境之間的界面。營養因素影響甲硫氨酸代謝和甲基對DNA和組蛋白甲基化的全球可用性。的WD變化顯示甲硫氨酸代謝[動物模型6，7 ]和基因轉錄物水平響應于膳食規定甲基供體[的8]。特別是，已知銅會干擾S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH）的表達和活性，而后者又會影響S-adenosylhomocysteine（SAH）水平和DNA甲基轉移酶活性和表達[ 9 ]。

通過轉錄因子介導的DNA甲基轉移酶和去甲基化酶的募集，可以在個別基因座處改變DNA甲基化，從而影響未來的轉錄因子結合效率[ 10 ]。基因啟動子的甲基化與基因表達呈負相關，而基因體甲基化則呈正相關。在患有常見肝病的患者中，已經在血液和肝臟中觀察到基因特異性DNA甲基化模式的變化，并且已經與肝病嚴重程度的不同階段相關[ 11 ]。雖然肝臟和大腦是WD中受影響最大的組織，但血漿中的銅也會增加[ 12]。增加的體液免疫應答，降低的細胞介導的免疫應答，并在伽馬Δ+ T細胞的增加已經在WD患者的血液中發現，這表明肝臟和血液可以具有特性甲基化的簽名在WD [ 13，14 ] 。

有強有力的證據支持動物模型中WD發病機制中甲硫氨酸代謝的改變，以及間接證據支持相同機制在人類發病和進展中的作用[ 15 ]。在本研究中，我們探討了這樣的假設：肝臟和血液中的DNA甲基化模式可以區分健康受試者和受其他肝臟疾病影響的受試者（包括非酒精性脂肪性肝病（NAFLD））的各種表型表現的WD患者。 ）和原發性硬化性膽管炎（PSC），最終目標是確定對致病機制，診斷標志物和治療目標的新見解。

結果

肝臟樣本的臨床特征

共有21個肝臟樣本可用于甲基化組分析，其中6個來自正常肝臟組織學的減肥手術的健康對照（HC），5個來自NAFLD（疾病對照，DC）的受試者，10個來自WD患者，包括來自肝硬化和急性肝衰竭患者的5例經皮肝活組織檢查和5例來自外植肝臟的活檢（附加文件1：表S1，附加文件2：表S2）。所有受試者的中位年齡為44歲（范圍22-72，三組之間沒有差異）。與WD患者相比，HC具有更高的BMI，因為樣本來自減肥手術患者。正如預期的那樣，與其他受試者相比，WD患者呈現出顯著更晚期的纖維化階段。

肝臟中的DMR將WD患者與健康和疾病對照區分開來

為了鑒定肝臟中WD特異性的DNA甲基化變化，來自WD（n? = 10），HC（n? = 6）和DC（n? = 5）受試者的樣品通過WGBS分析每組之間的DMR。鑒定了969個高甲基化區域和871個低甲基化區域，其特異性地區分WD與HC和DC受試者，但不是來自HC受試者的DC（圖 1a）。在這些WD特異性DMR中，18個通過FWER達到全基因組顯著性（表 1）。這18個DMR附近的基因包括那些在肝臟發育中具有已知功能的基因（BST1，FOXA1和VTN）和轉錄調控（FOXA1，MAFB，MN1，NACC2，ZNF689和ZNF785）。WD特異性肝臟DMR的基因本體分析顯示，高甲基化DMR附近的基因富含與急性炎癥反應，脂質分解代謝和葉酸代謝相關的功能（附加文件1：圖S1）。相反，低甲基化DMR附近的基因富含與體液免疫應答，脂肪酸轉運和糖酵解調節相關的功能。

圖1

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圖。1

肝臟DMR區分WD患者與對照組。鑒定了 WGBS衍生的DMR，其區分WD與HC和DC，但不區分來自HC的DC（WD n? = 10，HC n? = 6，DC n? = 5）。高甲基化的DMR在WD中具有較高的甲基化，而低甲基化的DMR在WD中具有較低的甲基化。b使用WD特異性肝臟DMR中甲基化的HC，WD和DC熱圖。繪制每個樣品相對于每個DMR的平均甲基化的甲基化百分比。C在WD特異性肝臟DMR中使用甲基化的主成分分析。每個點的大小表示患者的纖維化階段。省略號顯示95％的置信區間。對于這個和所有后續數字：DMR，差異甲基化區域; WD，Wilson病; WGBS，全基因組亞硫酸氫鹽測序; HC，健康控制; DC，疾病控制

表格1

WD特異性肝臟DMR具有全基因組顯著性和相關基因

FWER，家庭智能錯誤率

大多數WD受試者可從HC和DC受試者中清楚地區分甲基化水平的WD-肝特異性的DMR內的基礎上（圖 1 B，C）。這些DMR中的甲基化與性別，年齡，BMI，炎癥或脂肪變性無關（附加文件1：圖S2，附加文件2：表S3）。相反，在WD特定的DMRS整體，由第一主成分表示的甲基化，用纖維化（相關聯的p ?= 2.5E-4），其也可以在WD的樣品（圖中觀察到的異質性 1個 C）。單獨地，23個DMR（1％的WD特異性DMR）與纖維化相關（Bonferroni調整后p ?<0.05，附加文件2）：表S3）。此外，63例（3％）WD特異性DMR與先前在NAFLD受試者的纖維化甲基化研究中發現的DMR重疊[ 16 ]。然而，大多數個體WD特異性DMR與纖維化無顯著相關性。

為了研究纖維化發病前肝臟中WD特異性DNA甲基化的變化，將早期（0-1期）WD患者（n? = 3）與HC（n? = 6）和早期DC（n? = 4）科目。鑒定了124個高甲基化區域和70個低甲基化區域，區分早期WD患者，其與人口統計學協變量無關（附加文件1：圖S3，附加文件2：表S4）。其中76個早期區域和167個相關基因與從所有WD患者中鑒定的WD特異性肝臟DMR重疊，顯著富集（Hyper：p ?= 5.2E-82，Hypo：p?= 1.4E-31）。此外，在WD的tx-j小鼠模型中，基于人WD差異甲基化選擇的10個基因與病理早期的肝臟中的對照相比顯著差異表達（q ?<0.05，附加文件1：表S5）。這些基因的GATA6，HDAC5，Pmpca，Pnpla7和Tspan9上調，而FOXA1，MAFB，Nacc2，PCX和的Vtn被下調了。這些結果一起表明，在人WD肝臟中檢測到的甲基化差異具有功能性后果，并且與早期發病機制相關，而不是晚期纖維化的結果。

WD特異性高甲基化肝臟DMR富含肝臟增強劑和側翼活性肝臟啟動子

為了對從所有樣本中鑒定的WD特異性肝臟DMR進行功能性注釋，將Roadmap Epigenomics Project [ 17 ]中127種細胞和組織類型的組蛋白修飾ChIP-seq峰和染色質狀態預測與DMR染色體位點進行比較（圖 2））。高甲基化WD特異性DMR高度顯著富集肝臟H3K4me1和H3K4me3組蛋白修飾標記分別重疊87％和50％的高甲基化DMR（H3K4me1優勢比= 28.6，錯誤發現率（FDR）q ?<1.0E-319; H3K4me3賠率比率= 8.8，FDR q?= 7.6E-210）。相反，低甲基化的WD特異性DMR在許多組織類型中富含H3K4me1和H3K4me3標記。接下來，WD特異性肝臟DMR與ChromHMM染色質狀態預測重疊，后者使用組蛋白修飾ChIP-seq數據將基因組分成15個功能狀態。相比在所有的組織背景中增強子（ENH，黃色）和區域側翼活性轉錄起始位點（TssAFlnk，橙色）組合WD特定的DMRS顯示顯著富集（圖 2 b）中，與這些功能區的一個顯著顯著富集（圖 2 C）。高甲基化WD特異性DMR也分別在肝臟增強子和活性轉錄起始位點側翼區域特異性富集（附加文件1）：圖S4; Enh比值比= 11.6，FDR q ?= 5.5E-278; TssAFlnk比值比= 10.1，FDR q ?= 3.7E-192）。轉錄區側翼區域也顯著富集，但僅構成一小部分高甲基化DMR。

圖2

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WD特異性高甲基化肝臟DMR富含肝臟增強劑和側翼活性肝臟啟動子。使用LOLA 將 WD肝臟DMR與來自表觀基因組路線圖的組蛋白修飾ChIP-seq峰重疊，并對所有組織繪制比值比。b，c WD肝臟DMR與使用LOLA的表觀基因組路線圖中的染色質狀態重疊，并且將每個狀態重疊的DMR和背景區域的百分比繪制為b所有組織的平均重疊或肝臟的c重疊

肝臟中WD特異性高甲基化DMR富含肝相關轉錄因子結合位點

為了確定WD特異性肝臟DMR的甲基化差異與轉錄因子結合的潛在關聯，DMR與來自ENCODE的肝臟中的轉錄因子ChIP-seq峰重疊（圖 3a）并評估已知轉錄因子結合位點序列的富集。基序（圖 3 b）中。高甲基化的DMR富含HNF4A，RXRA，FOXA1和FOXA2的肝結合位點和序列基序，而低甲基化的DMR沒有富集這些因子（附加文件1：圖S5）。當高甲基化DMR與HNF4A，RXRA，FOXA1和FOXA2的重疊結合位點重疊時，它們富集重疊相同的DMR，包括82個含有所有這四種因子的區域（圖 3）c，d）。一種這樣的DMR是在LRRC3，用全基因組顯著性在WD肝特異性甲基化，并含有重疊為這些因素所有四個（圖肝結合位點 3 E）。

圖3

WD特異性高甲基化肝臟DMR富含肝臟相關轉錄因子結合位點。一個 WD肝臟的DMR使用LOLA可用肝轉錄因子芯片起峰重疊從ENCODE和比值比作圖并通過高甲基化DMR比值比來分類的。b使用HOMER測試WD肝臟DMR序列的富集的已知轉錄因子基序，并繪制具有肝臟ChIP-seq數據的因子。c與頂部肝臟轉錄因子ChIP-seq峰重疊的高甲基化WD肝臟DMR重疊。d轉錄因子重疊富集。e重組轉錄因子結合位點和高甲基化DMR的UCSC基因組瀏覽器視圖LRRC3

WD進展相關的肝臟DMR顯示補體激活和胚胎發育途徑的失調與疾病嚴重性的增加

為了確定與WD進展相關的肝臟DNA甲基化變化，早期（0-1階段）和晚期纖維化階段（≥2）WD患者進行了比較并評估了DMR（早期WD n? = 3，晚期WD n? = 7） 。1339米高甲基化和低甲基化1119的區域被確定為與疾病進展變化的，受試者可以通過級甲基化這些的DMR的基礎上進行分離（圖 4的a，b）。然而，甲基化與協變量無關（附加文件2：表S6）。在這些WD進展DMR中，15個達到全基因組顯著性（附加文件1：表S7）。這些重要DMR附近的基因包括參與血液凝固的基因（F7，F10），免疫激活（RNF123，SIGLEC15）和線粒體功能（KAT2A，LIAS和SARDH）。所有WD進展DMR的功能富集分析顯示，高甲基化區域富集參與補體激活，體液免疫應答和脂質穩態的基因，而低甲基化區域富集參與心臟，呼吸，肌肉和內胚層發育的基因（圖2）。 4 c）。這些數據表明在WD進展期間發生與補體激活和胚胎發育相關的基因的DNA甲基化改變。

圖4

肝臟DMRs區分早期和晚期WD患者。WD進展相關的肝臟DMR富集參與補體激活和胚胎發育的基因。高甲基化的DMR在晚期WD中具有較高的甲基化，而低甲基化的DMR在晚期WD中具有較低的甲基化（早期WD n? = 3，晚期WD n? = 7）。在早期與晚期WD肝臟DMR中使用甲基化的熱圖。繪制每個樣品相對于每個DMR的平均甲基化的甲基化百分比。b在早期與晚期WD肝臟DMR中使用甲基化的主成分分析。省略號顯示95％的置信區間。C與背景相比，早期與晚期WD肝臟DMR的GREAT功能富集分析的結果。顯示了來自FDR q ?<0.05的高甲基化或低甲基化DMR的基因本體數據庫的前10個術語（虛線表示顯著性閾值）。對于這個以及隨后的所有數據：FDR; 錯誤的發現率

WD相關的肝臟DMR基因富含藥物靶標

鑒定與WD診斷和嚴重程度相關的肝臟中具有差異甲基化的基因提供了預測可能與這些基因相互作用并可能改變WD病理學的治療劑的機會。為了鑒定與WD DMR相關的藥物，已知藥物 - 基因相互作用從藥物基因相互作用數據庫[ 18 ]獲得并與WD DMR基因重疊（附加文件2：表S8）。最顯著富集的藥物是bepridil，它是一種鈣拮抗劑，已知會影響線粒體功能[ 19 ]，它與4種基因在早期WD中的差異甲基化相互作用：ATP1A1，CACNA1H，TNNC1和VIPR2（p ?= 1.2E-4）。WD特異性肝臟DMR基因顯著富集與美法侖的相互作用，后者已被用于治療肝臟轉移[ 20 ]，并與FANCC，GSTP1，MGMT，OPLAH和PLAT基因相關（p ?= 6.5E-4）。雖然這些藥物對WD病理學的影響無法根據此分析進行預測，但這些數據確實提出了在WD模型系統中進一步研究的化合物。

WD相關的肝臟甲基化不受細胞類型變化的影響

在諸如肝臟的大塊組織中觀察到的DNA甲基化變化可受到樣品之間各個細胞類型的比例差異的影響。為了確定細胞類型的變化是否影響本研究中鑒定的DMR，我們檢測了人肝細胞（HEP），肝星狀細胞（HSC）或肝竇上皮細胞（LSEC）中特異性高甲基化的啟動子組[ 21 ]。在所有已鑒定的WD DMR中，只有63種WD特異性，3種早期WD特異性和86種WD進展DMR與細胞類型特異性甲基化啟動子重疊（附加文件1）：圖S6a）。來自每次比較的少于5％的DMR位于細胞類型特異性甲基化啟動子。在用于鑒定DMR的所有樣品組之間比較細胞類型特異性啟動子的甲基化百分比（附加文件1：圖S6b-d，附加文件2：表S9）。大多數細胞類型特異性啟動子在任何樣品組之間沒有差異甲基化。與HC相比，WD樣品在7％的HEP啟動子，4％的HSC啟動子和7％的LSEC啟動子上名義上差異甲基化（p ?<0.05）。與早期WD相比，在晚期觀察到最大的影響，其中8％的HEP啟動子，9％的HSC啟動子和13％的LSEC啟動子名義上差異甲基化（p?<0.05）。這些結果表明，細胞類型比例的改變對WD肝臟中觀察到的差異甲基化沒有主要影響。

血液中的DMR將WD與對照區分開來

雖然肝臟WD特異性DMR的鑒定與疾病見解最相關，但我們詢問是否可以在更易獲得的血液樣本中鑒定出類似的表觀基因組特征作為潛在的WD生物標志物。在兩個獨立的群組中共有82個全血樣品可用于DNA提取和甲基化組分析（附加文件1：表S10，附加文件2：表S11）。WD患者均在診斷時招募，而不是抗銅治療。對于NAFLD和PSC受試者，從無纖維化到肝硬化，可直接從肝臟活組織檢查或非侵入性評估獲得纖維化階段。WD的全血甲基化組（n? = 40），HC（n?= 12），并且通過WGBS評估DC（其包括NAFLD和PSC患者，n? = 20），并且針對每個成對比較調用DMR（圖 5a）。鑒定出187個高甲基化和75個低甲基化的WD特異性DMR，區分WD與HC和DC患者。在這些WD-特定血液的DMR使用甲基化水平，大部分患者從WD HC和DC患者分離（圖 5 B，C）。相反，大多數DMR中的甲基化與人口統計學協變量無關（附加文件2：表S12）。

圖5

血液DMR區分WD患者與對照組。鑒定了 WGBS衍生的DMR，其區分WD與HC和DC，但不區分來自HC的DC（WD n? = 40，HC n? = 12，DC n? = 20）。b使用WD特異性血液DMR中的甲基化，HC，WD，NAFLD和PSC血液的熱圖。繪制每個樣品相對于每個DMR的平均甲基化的甲基化百分比。c在WD特異性血液DMR中使用甲基化的主成分分析。省略號顯示95％的置信區間

由于肝臟增強子中肝臟WD特異性DMR的富集，還評估了血液WD特異性DMR中的染色質狀態富集（附加文件1：圖S7）。總體而言，DMR富集了免疫細胞增強子區域，尤其是在造血干細胞中預測的那些，其重疊51％的DMR（優勢比= 9.1，FDR q ?= 6.1E-58）。另外，高甲基化區域在單核細胞，中性粒細胞，B細胞和自然殺傷細胞增強劑中富集更多，而低甲基化區域在T細胞增強劑和啟動子中更富集。

血液中的DNA甲基化反映了WD特異性肝臟DMR的一個子集

正如預期的那樣，血液中鑒定的WD特異性DMR的數量遠低于肝臟中鑒定的數量。然而，血液DMR附近的99個（22％）基因與肝臟中鑒定的基因重疊，顯著富集（Hyper：p ?= 1.1E-25，Hypo：p ?= 2.0E-6，附加文件1：圖S8a） 。在血液和肝臟中具有重疊位置和共同方向的10個DMR附近的基因包括CSAD，ITGB7，LSM12，PSMD9，RRN3P2，SNX29P2和PFN3。特別是，HDAC5內含子和LSM12上游的肝臟DMR在WD肝臟和血液中特異性地和顯著地高度甲基化（附加文件1：圖S8b-d）。

人和小鼠WD DMR基因在組織內和組織之間重疊

為了確定與ATP7B功能喪失相關的DMR基因是否在人和小鼠之間保守，肝臟和血液中的人DMR基因與先前在WD模型tx-j小鼠的胎肝中鑒定的DMR基因重疊，與野生型C3H小鼠相比較。 （附加文件1：圖S9，附加文件2：表S13）[ 15 ]。在人肝臟和小鼠胎肝中，20個基因在相同方向上差異甲基化（hyper：q ?= 7.7E-2，hypo：q ?= 4.7E-4）。在ATP7B功能喪失時具有保守差異甲基化的基因中有ALKBH5，GRID2IP，KDELR2，CACNA1H，CAMK2B和WNT11。在血液中，7個基因在與小鼠胎肝相同的方向上差異甲基化（hyper：q ?= 6.6E-3，hypo：q ?= 1.3E-1）。其中，ZNF750和MAD1L1在人肝臟中也是差異甲基化的。這些基因的保守差異甲基化表明它們代表了WD病理學中重要的早期擾動。

血液中的DMR區分患有肝臟和神經系統WD表型的患者

表型變異是WD的一個重要特征，不能通過基因型解釋，因此我們分析了血液中的甲基化，以確定是否存在分化WD肝病（WDH）和神經系統（WDN）癥狀的WD患者（WDH n? = 20，WDN n）? = 20）。總共1346個區域的甲基化了，而1514個區域被在WD患者肝癥狀低甲基化相比，那些與神經癥狀（圖 6的a，b）。患者可以通過表型清楚地聚集，表明血液中存在與WD癥狀相關的表觀遺傳差異。相反，WD表型DMR中的甲基化與協變量無關（附加文件2：表S14）。所有DMR附近的基因都富集了異常B細胞生理學中的功能，而WDH中低甲基化區域附近的基因富含癡呆，精神衰退和屬于染色質修飾多梳抑制復合物1（PRC1）的功能（圖6）。 C）。類似于WD特異性血液DMR，WD表型DMR富含免疫細胞增強劑，尤其是造血干細胞中的那些（附加文件1：圖S7c，d）。獨特地，WD表型DMR富含二價增強子，其由H3K4me1和H3K27me3定義并由PRC1調節，并且特別富集在T細胞中（優勢比= 4.6，FDR q ?= 1.5E-171）。

圖6.jpg

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血液DMR區分患有肝（H）或神經（N）WD的患者。鑒定了區分WDH和WDN的DMR。一個使用甲基化WDH與WDN血液的DMR熱圖。繪制每個樣品相對于每個DMR的平均甲基化的甲基化百分比（WDH n? = 20，WDN n? = 20）。b使用WDH中甲基化與WDN血液DMR的主成分分析。省略號顯示95％的置信區間。c與背景相比，WDH與WDN血液DMR的GREAT功能富集分析的結果。來自FDR的基因本體數據庫的術語q?顯示<0.05，虛線表示顯著性閾值。“所有DMR”（綠色）指高甲基化和低甲基化DMR; “低甲基化DMR”（藍色）是指與WDN相比在WDH中具有較低甲基化的DMR

WD表型血液DMR在獨立隊列中對肝臟和神經系統WD進行分類

使用基于血液的生物標志物區分WD表型在患者診斷中具有潛在的應用。為了評估所鑒定的WD表型血液DMR的準確性以將WD患者分類為肝臟或神經形式，在原始患者群組中對Adaboost分類器在這些區域中的血液甲基化進行訓練并且在獨立群組上進行測試（WDH n? = 5） ，WDN n? = 5）。識別出44個DMR，其特征重要性大于零，并用于模型中（圖 7a，b）。這些DMR附近的基因包括幾個具有已知神經功能的基因，如CHRNB3，CYP46A1，GALR1，LHX4，NGF，NPTXR，SHH和WNT7B，和肝功能，包括ONECUT1（圖 7 C，附加文件2：表S15）。重要的是，分類器能夠正確地識別除了一個獨立測試樣品之外的所有樣品，其具有WD的肝臟或神經形式（精確度= 0.9，曲線下的接收器操作特征（ROC）面積（AUC）= 0.8，圖3）。 7 d）。這些結果表明，在這44個區域中使用血液DNA甲基化的患者中可以鑒定出WD表型。

圖7

選擇的WD表型血液DMR在獨立的測試組中對來自神經系統WD的肝臟進行分類。使用AdaBoost算法的分類器用WD患者血液中WD表型DMR的甲基化值訓練（WDH n? = 20，WDN n? = 20）。a訓練后2860個DMR中的每一個都確定了特征重要性。b在訓練樣本中使用甲基化的分類器中使用的44個DMR的熱圖。c特征重要性≥0.04的DMR附近的基因。d分類結果為WD患者的測試隊列。在圖中，該列代表真實的表型，而顏色代表預測的表型（WDH n? = 5，WDN n?= 5，精度= 0.9，ROC AUC = 0.8）

討論

這是第一項通過WGBS在全基因組水平上研究WD患者甲基化變化的研究。這種表觀基因組特征揭示了肝臟特異性增強子和轉錄因子結合位點發生的甲基化變化，表明WD是一種遺傳性疾病，其進展和潛在的發病機制與表觀遺傳變化有關。與健康受試者和患有其他肝病的受試者相比，我們在WD患者中證實了特定的肝臟發病相關DNA甲基化標記。在來自不同隊列的患者的肝臟和血液中鑒定了這些DNA甲基化差異的子集，支持血液中的甲基化標記物可以反映另一組織中的疾病發病機理的前提。此外，DNA甲基化差異也基于肝臟與神經系統表現區分患者，特別是編碼具有機械意義的表觀遺傳因子的基因，例如PRC1中的那些。這些區域的一小部分可以在獨立的隊列中對WD患者表型進行分類，證明了DNA甲基化的診斷潛力。WD的這種表觀基因組特征揭示了對基因途徑，基因 - 藥物相互作用和潛在生物標志物的見解，這些可能在臨床上用于WD的早期干預和治療。證明了DNA甲基化的診斷潛力。WD的這種表觀基因組特征揭示了對基因途徑，基因 - 藥物相互作用和潛在生物標志物的見解，這些可能在臨床上用于WD的早期干預和治療。證明了DNA甲基化的診斷潛力。WD的這種表觀基因組特征揭示了對基因途徑，基因 - 藥物相互作用和潛在生物標志物的見解，這些可能在臨床上用于WD的早期干預和治療。

我們之前在WD的tx-j小鼠模型中的數據顯示，胎兒肝臟中肝細胞生長和成熟缺乏的全面減少，通過母體膳食補充甲基供體膽堿來減輕[ 22 ]。在tx-j小鼠的胎肝中也觀察到差異甲基化，其通過補充膽堿改善[ 15 ]。在患者肝臟中鑒定的差異甲基化基因與tx-j胎兒肝臟中的差異甲基化基因顯著重疊，并且包括編碼在肝臟發育中重要的轉錄因子的幾個基因。GATA6參與肝臟成熟的多個階段，并在胎兒早期發育過程中在肝細胞中高表達[ 23 ]。FOXA1在肝臟胚胎發生過程中啟動規范是至關重要的[ 24 ]并且也在成年肝臟中表達，而VTN，一種FOXA1靶基因，參與胚胎干細胞成熟[ 25 ]并且已經顯示在胎兒肝星狀細胞中被上調[ 26 ]。GATA6，FOXA1和的Vtn還發現在成年TX-J肝臟差異表達。WD的這些DNA甲基化特征指向肝臟發育和再生途徑，這些途徑又可能受胎兒和成年生命中甲基供體飲食因素的影響。

在WD中鑒定的高甲基化DMR特異性地富集在肝特異性增強子和轉錄因子結合位點中，這是WD領域的新發現。肝特異性增強子中的高甲基化DMR可反映增強子使用或HNF4A結合的特定缺陷。HNF4A是肝細胞成熟的關鍵轉錄因子，是維持肝細胞上皮表型所必需的[ 27 ]。之前的一份報告顯示，WD患者HNF4A和RXR與啟動子反應元件的結合受損[ 28 ]。此外，肝臟X受體/類視黃醇X受體的失調與WD的發病機制有關 [29]]。發現HNF4A，RXR，FOXA1和FOXA2的肝結合位點在LRRC3的啟動子中顯著高度甲基化的WD特異性肝DMR處重疊。與早期WD相比，LRRC3的另一個DMR在晚期顯著高度甲基化。以前，LRRC3與鉑誘導的肝損傷和氧化應激的易感性有關[ 30 ]。我們的結果表明HNF4A和肝臟特異性增強子和啟動子中的其他轉錄因子結合位點的高甲基化為WD發病機制中的這些先前分子發現提供了新的潛在解釋。

另外，從WD的這個表觀研究得到的見解可對有爭議銅累積和潛在的降低肝癌風險之間在WD [關系光棚31，32 ]。最引人注目的發現之一是肝臟和血液之間重疊的DMR基因在癌癥的表觀遺傳機制中起主要作用。特別是，HDAC5活化與肝細胞增殖和肝癌發生有關[ 33 ]，并參與脂質代謝和脂肪酸氧化[ 34 ]。無論NCOR2和CTBP2在WD患者的肝臟和血液中甲基化和功能在癌癥失調轉錄共抑制。NCOR2與兩個核受體，包括LXR和RXR，和IIa類HDAC的，如HDAC5 [相互作用35，36 ]。NCOR2在膀胱癌，乳腺癌和前列腺癌中也有差異表達[ 35 ]。CTBP2的功能是在分化期間募集PRC2蛋白以添加H3K27me3，并且還與HDAC相互作用[ 37 ]。此外，CTBP2在前列腺癌中過表達并與腫瘤進展相關[ 38 ]。其他基因，包括GATA2，GADD45B和MIR126，WD肝臟和血液中的差異甲基化，也在癌癥的表觀遺傳機制中發揮作用。WD中這些表觀遺傳調節因子的失調可能會影響這些患者對癌癥的易感性。

先前的幾項研究試圖將全血或外周血單核細胞（PBMC）中特定的DNA甲基化變化確定為肝病的指標。特別是，對NASH患者的分析發現了與膠原蛋白含量相關的基因[ 11 ]和脂肪變性[ 39 ]的DNA甲基化變化]。我們的深入分析確定了可在診斷時區分早期和晚期WD和肝臟與神經系統表型的DMR。據我們所知，這是第一項確定發病機制 - 有意義標志物組合的研究，以及與臨床和遺傳參數相關的診斷潛力。在我們對早期WD肝臟樣本的晚期分析中，我們發現了補體途徑中涉及的高甲基化基因，這些基因以前被證明是WD的血清生物標志物 [40]。]。我們的研究描述了一組來自全血的差異甲基化基因與WD肝臟中鑒定的基因重疊，表明這些基因座可以作為WD在未來研究中疾病進展的各個階段的潛在血液生物標志物。

該研究的局限性包括使用全血和全肝組織，因為兩者都是許多不同細胞類型的混合物。在肝臟中評估細胞類型的影響，其中發現在特定肝細胞類型中大多數高甲基化的啟動子與WD肝臟中的差異甲基化無關。第二個限制是健康體重的個體缺乏肝臟控制。通過檢查與DMR甲基化無關的BMI來控制這一點。與脂肪酸氧化和脂質分解代謝相關的途徑中基因的DNA甲基化的變化與WD動物模型中下調的脂質代謝途徑的先前證據一致[ 8]。第三個限制是甲基化分析的覆蓋率相對較低，這可能限制了檢測所有可能的甲基化差異的能力。然而，相對大量的樣本允許我們捕獲大量的DMR，這些DMR在獨立群組中得到驗證，提供了WD中DNA甲基化作用原理的證據。此外，所述測序方法的顯著成本可被視為DMR標記物作為WD診斷測試的未來適用性的限制因素。使用特定WD預測性DMR的減少表示將顯著降低成本，增加測序覆蓋率，并使其成為臨床實踐的可訪問技術。

結論

WD代表一種非常獨特的遺傳條件，其中ATP7B中的突變與銅，飲食和代謝相互作用，影響其復雜和變化的表型，因此血液或其他可及組織中疾病進展的表觀遺傳指示顯然在臨床上是有用的。這些DMR可能代表WD的表觀基因組特征，包括銅水平升高，疾病進展反應和飲食等環境輸入的直接改變。此外，對編碼藥物可靶向表觀遺傳修飾因子（如HDAC5）的基因的DNA甲基化變化的鑒定可揭示對WD治療中現有藥物的再利用的見解。

方法

人體肝臟活組織檢查

來自WD患者的樣品獲自Heidelberg大學（德國海德堡）和加州太平洋醫學中心Ibrahim El-Hefni Biorepository（美國加利福尼亞州舊金山）。來自海德堡大學的肝臟樣本來自接受肝臟移植的WD患者的外植肝臟。來自加利福尼亞太平洋醫療中心的肝臟樣本是通過經皮肝臟活組織檢查獲得的，用于診斷和分期目的。來自DC和HC受試者的肝樣品獲自加利福尼亞太平洋醫療中心和加州大學戴維斯GI生物庫（附加文件1：表S1，附加文件2）：表S2）。DC患者的經皮肝臟活檢取自NAFLD。在患有非糖尿病的受試者的減肥手術時獲得HC肝臟活組織檢查，脂肪變性小于5％且組織學上無炎癥。如前所述，活組織檢查對炎癥，脂肪變性和炎癥進行分級[ 41 ]。

人體全血樣本

來自患有WD的患者（與提供肝臟活組織檢查的患者不同的組）的樣品獲自精神病學和神經病學研究所（波蘭華沙）。HC樣本來自華沙和薩克拉門托當地社區的志愿者。DC樣本來自診斷為NAFLD和PSC的患者，他們在加州大學戴維斯分校肝病學診所連續出現進行評估，并同意提供全血用于DNA提取，以存儲在加州大學戴維斯分校生物庫中。選擇NAFLD和PSC作為DC，因為在WD的鑒別診斷中應考慮這兩種條件，NAFLD患者呈現表觀遺傳變化，并且PSC也與銅積累相關。在HC和WD組中，全血樣本按年齡，性別和BMI進行匹配（附加文件1：表S10，附加文件2：表S11）。患有其他慢性肝病（包括乙型肝炎或丙型肝炎，自身免疫性肝炎，酒精性肝病，原發性膽汁性膽管炎，血色素沉著癥）的患者被排除在外。根據萊比錫標準確定WD患者在診斷時被招募，因此不進行抗銅治療。選擇測試組中的WD患者具有ATP7B H1069Q錯義突變。根據患者的流行表型將患者分類為肝臟或神經系統表現。將所有樣品去標識，在干冰上運輸，并儲存在-80℃下用于進一步分析。

全基因組亞硫酸氫鹽測序（WGBS）和分析

使用TruSeq DNA甲基化試劑盒（Illumina，San Diego，CA，USA）從亞硫酸氫鹽轉化的DNA制備WGBS文庫。來自肝臟和血液訓練樣品的文庫在HiSeq4000上測序，而來自血液測試樣品的文庫在HiSeq2000（Illumina，San Diego，CA，USA）上測序。將讀數與hg38參考基因組比對，并在HC，WD和DC樣品之間鑒定DMR。WGBS數據分析的所有代碼都可以在GitHub上獲得（https://github.com/cemordaunt/WilsonDiseaseEpigenome）。

關于WGBS數據分析和小鼠模型研究的其他方法在附加文件1：補充方法中給出。

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和原發性硬化性膽管炎（PSC）