熒光分析法

光致發光：有些物質受到光照射時，除吸收某種波長的光之外，還會發射出比原來所吸收光的波長更長的光

特點：靈敏度高，選擇性好，檢測限低于紫外-可見分光光度法

分為：紫外-可見熒光、紅外熒光、X射線熒光

第一節：熒光分析法的基本原理

分子熒光

分子熒光的產生

分子的電子能級與激發過程：分子的基態、激發單重態S、激發三重態T

熒光產生：

1. 振動弛豫：處于激發態各振動能級的分子是通過與溶劑分子的碰撞而將部分振動能量傳遞給溶劑分子，其電子則返回到同一電子激發態的最低振動能級的過程；無輻射躍遷、只能在同一電子能級內進行
2. 內部能量轉換（內轉換）：當兩個電子激發態之間的能量相差較少時以致其振動能級有重疊時，受激分子常由高電子能級以無輻射方式轉移至低電子能級的過程
3. 熒光發射：激發單重態最低振動能級的分子以輻射的形式發射光量子至基態的任一振動能級上
4. 外部能量轉換（外轉換）：溶液中激發態分子與溶劑分子或與其他溶質分子之間相互碰撞而失去能量，以熱能的形式釋放能量的過程，常發生在激發態最低振動能級向基態轉換，外轉換降低熒光強度
5. 體系間跨越：處于激發態分子的電子發生自旋反轉而使分子的多重性發生變化的過程，降低熒光強度，甚至熄滅；含重原子的分子，體系間跨越最常見；溶液中存在氧分子等順磁性分子時也容易發生體系間跨越
6. 磷光發射：分子在激發三重態的最低振動能級可以存活一段時間，然后返回至基態各個振動能級而發出光輻射，這種輻射稱為磷光。波長更長，壽命長，因此三重態分子常以無輻射方式返回基態，因此室溫下很少呈現磷光，一般需要冷凍或固定化

熒光的激發光譜和發射光譜

激發光譜：不同激發波長的輻射引起物質發射某一波長熒光的相對強度（檢測的熒光波長不變）

熒光光譜：表示在所發射熒光中各種波長組分的相對強度（激發波長不變）

溶液熒光光譜的特征：

1. 斯托克斯位移：熒光發射波長總是大于激發波長，內轉換和振動弛豫及熒光發射返回到基態各個能級
2. 熒光光譜的形狀與激發波長無關：熒光光譜只有一個發射帶
3. 熒光光譜與激發光譜的鏡像關系：激發光譜與熒光光譜的形狀相似，而且兩者間存在鏡像對稱關系

熒光與分子結構的關系

熒光壽命和熒光效率

熒光壽命：當除去激發光源后，分子的熒光強度降低到最大熒光強度的1/e所需的時間用表示

利用分子熒光壽命差別可以進行熒光物質混合物的分析

熒光效率：執法態分子發射熒光的光子數與幾臺分子吸收激發光的光子數，用表示

有機化合物分子結構與熒光的關系

發射熒光條件：強的紫外可見吸收；一定的熒光效率

一般長共軛分子具有較強紫外吸收，剛性分子平面具有較高的熒光效率

本來不發生熒光或熒光較弱的物質與金屬離子形成配位化合物后，如果剛性和共平面性增加那么就可以發射熒光或增強熒光，位阻效應導致的共平面性下降則熒光減弱，對于順反異構體，反式空間位阻小，共平面性大，熒光強

增加π電子的取代基使熒光加強，一般為給電子取代基；減弱π電子共軛的使熒光減弱甚至熄滅，一般為吸電子取代基；還有對π電子共軛影響較小的取代基對熒光影響不大

熒光試劑

1. 熒光胺：脂肪族和芳香族伯胺
2. 鄰苯二甲醛（OPA）：伯胺，脯氨酸及羥脯氨酸以外的氨基酸
3. 1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘（丹酰氯）：伯胺、仲胺、酚基
4. 測定無機離子的熒光試劑：

影響熒光強度的外部因素

1. 溫度：一般隨溫度升高熒光強度降低
2. 溶劑：一般熒光波長隨溶劑極性增強而長移，熒光強度也增強，溶劑黏度越低，熒光越弱
3. 酸度：酸度影響溶劑中分子的存在形式從而影響熒光強度
4. 熒光熄滅劑：熒光物質分子與溶劑分子或其他溶質分子相互作用引起熒光強度降低的現象，如鹵素、重金屬離子、氧分子及硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化合物。熒光熄滅原因：熒光物質的分子與熄滅劑分子碰撞損失能量；熒光物質的分子與熄滅劑作用而生成本身不發光的物質；溶解氧的存在；濃度較大發生自熄滅現象。熒光熄滅法（如果一個熒光物質在加入某種熄滅劑后，熒光強度的減弱和熒光熄滅劑的濃度呈線性關系）
5. 散射光：
   1. 瑞利散射：
   2. 拉曼散射：影響較大，必須消除，選用適當的激發波長可以消除拉曼光散射

第二節：熒光定量分析方法

溶液熒光強度與物質濃度的關系

低濃度（）時，溶液的熒光強度與溶液中熒光物質的濃度呈線性關系

熒光定量分析方法

1. 工作曲線法：與紫外-可見分光光度法不同的是，在繪制工作曲線時，常采用系列中某一對照品溶液作為基準，將空白溶液的熒光強度讀數調至0，將該對照品溶液的熒光強度讀數調至100%或50%，然后測定其他各個對照品溶液的熒光強度
2. 比例法：工作曲線通過原點或者扣除空白溶液的熒光強度
3. 聯立方程法：用于多組分混合物的熒光分析

第三節：熒光分光光度計和熒光分析技術

熒光分光光度計

• 濾光片熒光計：不能測定光譜，只能定量分析
• 濾光片-單色器熒光計：將發射濾光片用光柵代替，不能測激發光譜，但能測熒光光譜
• 熒光分光光度計：將兩個濾光片都用光柵替代，可以繪制光譜

1. 熒光分光光度計主要部件：激發光源（氘燈）、激發單色器、發射單色器、樣品池、監測系統
2. 儀器校正：
   1. 靈敏度校正：常用1 的硫酸奎寧對照品溶液0.05 mol/L（硫酸中）
   2. 波長校正：用汞燈的標準譜線對單色器波長刻度進行校正
   3. 激發光譜和熒光光譜的校正：由于光源強度隨波長而變；每個檢測器對不同波長光接受程度不同；檢測器的感應與波長不呈線性

其他熒光分析技術

1. 激光誘導熒光分析：激光作為光源，靈敏度更高
2. 時間分辨熒光分析：利用不同物質的熒光壽命不同，在激發和檢測之間延緩時間不同進行選擇性檢測，應用于免疫分析
3. 同步熒光分析：在熒光物質的激發光譜和熒光光譜中選擇一適宜的波長差，同時掃描發射波長和激發波長
4. 膠束增敏熒光分析：減弱碰撞，減少無輻射躍遷；降低熒光熄滅劑作用；降低熒光物質自熄滅