內(nèi)皮活性增強子的重構(gòu)與肺動脈高壓中異常基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相關(guān)
Remodeling of active endothelial enhancers is associated with aberrant gene-regulatory networks in pulmonary arterial hypertension
https://www.nature.com/articles/s41467-020-15463-x
?研究背景
?實驗方法
?實驗結(jié)果
?結(jié)論與討論
什么是肺動脈高壓?
目前報道約15%肺動脈高壓(PAH)患者為家族性。其中70%的人攜帶BMPR2基因突變。另外30%的散發(fā)性PAH病例也有BMPR2突變，統(tǒng)稱為遺傳性(H)PAH。還有一類不知道原因的，統(tǒng)稱為特發(fā)性(I)PAH。
患者癥狀表現(xiàn)為疲倦和呼吸急促，有時會持續(xù)數(shù)年，但由于這些患者癥狀不夠典型（很多疾病都有此表現(xiàn)），在疾病進入病理晚期之前，PAH的診斷往往比較困難。
目前的治療，包括皮下或靜脈注射前列環(huán)素，本質(zhì)上都是擴張血管的；雖然它們大大降低了死亡率，改善了生活質(zhì)量，但PAH的5年存活率低于60%。
Disease: pulmonary arterial hypertension (PAH)
-
Object: pulmonary arterial endothelial cells (PAECs)
下面是肺動脈高壓進展的模式圖，由于近端動脈的閉塞和遠端微血管的丟失，肺循環(huán)中的壓力逐漸升高，最終導致右側(cè)心力衰竭。
怎么進行研究
大多數(shù)特發(fā)性PAH患者沒有已知的原因突變，因此，作者試圖通過研究PAH患者與健康對照組疾病相關(guān)組織中染色質(zhì)標記和基因表達的分子差異來評估潛在的非編碼基因調(diào)控元件的變異對疾病機制的影響。
對來自遺傳性肺動脈高壓(HPAH；攜帶BMPR2突變；n=2)和特發(fā)性肺動脈高壓(IPAH；未知突變；n=8)和對照組(n=9；圖1A，補充圖1A)共19例來源的小肺動脈內(nèi)皮細胞(PAECs)進行三個活性組蛋白標記(H3K27ac，H3K4me1，H3K4me3)和RNA-Seq進行了芯片測序序列分析。
從患者肺移植過程中采集的PAECs細胞培養(yǎng)3-5代，以獲得CHIP-SEQ實驗所需的數(shù)量，并盡量降低批次效應(yīng)。
補充一下背景，參考http://www.lxweimin.com/p/f7d7bf8aec0b
使用到的樣本信息及分析軟件：
使用配對末端標簽測序的染色質(zhì)相互作用分析技術(shù)CHIA-PET (Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing. )
配對末端標簽測序分析染色質(zhì)相互作用(chromatin interaction analysis by paired-end tag sequencing,ChIA-PET)技術(shù)是一項在全基因組范圍內(nèi)分析遠程染色質(zhì)相互作用的新技術(shù)。它把染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)技術(shù)、染色質(zhì)鄰近式連接(chromatin proximity ligation)技術(shù)、配對末端標簽(paired-endtag,PET)技術(shù)和新一代測序(next-generation sequencing)技術(shù)融為一體,在基因組三維折疊和loop狀態(tài)下分析基因表達和調(diào)控。
染色質(zhì)遠程交互在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。2002年起,染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)(3C)及其衍生方法不斷發(fā)展,該方法用于揭示DNA與DNA之間的空間位置關(guān)系。基于配對末端標簽測序的染色質(zhì)交互分析技術(shù)(ChIA-PET)將3C與ChIP相結(jié)合,可用于描繪全基因范圍內(nèi)特定蛋白介導的染色質(zhì)交互圖譜。ChIA-PET Tool為一個ChIA-PET數(shù)據(jù)處理的軟件,最初于2010年公開發(fā)表。
下面這張圖是搜索自網(wǎng)絡(luò)介紹CHIA-PET背景相關(guān)示意圖，及相關(guān)數(shù)據(jù)分析軟件的。
下面正式開始正文的描述：
研究流程如下：
從患者和病人肺動脈分離PAECs進行培養(yǎng)3-5代后進行CTCF的CHIA-PET實驗與活性增強子調(diào)控的靶基因進行疾病相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析。
研究結(jié)果如下：
在PAH患者中發(fā)現(xiàn)活性增強子(H3K27ac)的廣泛重構(gòu)。而通用增強子標記(H3K4me1)、啟動子標記(H3K4me3)和基因表達(RNAseq)沒有明顯變化。這表明發(fā)生改變的是活性增強子。
1.Extensive remodeling of H3K27ac in PAH patients vs controls
染色質(zhì)標記pattern符合預期：H3K4me3和H3K27ac的peaks在轉(zhuǎn)錄起始點(TSS)富集，并與基因表達水平正相關(guān)(Pearson‘s R=0.51和R=0.59)，而H3K4me1的peaks更遠離TSS且與RNA相關(guān)性較低(R=0.22)。作者觀察到HPAH患者與IPAH之間相似的Fold change變化(補充圖1F)，這表明分子檢測之間的信號是大致一致的(圖1b，c)。因此作者將IPAH和HPAH患者結(jié)合起來進行所有后續(xù)分析。
對每種組蛋白標記和RNAseq的差異區(qū)域(前1000個變異最大的peaks/基因)進行的主成分分析(PCA)表明，只有H3K27ac能夠?qū)颖痉譃镻AH患者和健康對照組(圖1d；補充圖1C)。
作者還發(fā)現(xiàn)，在IPAH和對照(圖1e和補充圖1E)之間，有數(shù)千個位點在H3K27ac有顯著的差異變化(FDR<0.05)的11,701個)，而在H3K4me1和H3K4me3的差異變化的peaks很少（在FDR<5%處沒有發(fā)現(xiàn)差異表達基因，在<10%處只有少數(shù)區(qū)域顯著（圖未展示））。
由于前人的研究已經(jīng)在不同的樣本數(shù)據(jù)集中[9-11]已經(jīng)確定了一些在PAH中的差異表達基因，因此作者在部分樣品(兩個IPAH，兩個HPAH，四個對照)中對一些基因(圖1f)的基線表達水平進行了qPCR驗證，這些基因被選擇的原因是其啟動子中具有一系列差異H3K27ac信號(圖1g)。
在qPCR檢測中，它們在基線基因表達水平上都沒有顯示出任何差異。但當作者比較組蛋白標記和RNAseq的樣品之間的成對相關(guān)性分析時發(fā)現(xiàn)RNAseq的變異水平要高得多，無論這些樣本來自PAH還是對照，這表明缺乏差異表達的基因可能部分是由樣本的異質(zhì)性導致的(補充圖1G)。
為了獲得對差異修飾的H3K27ac peaks的功能檢測，我們使用表觀基因組項目(Epigenomic roadmap project)[12]的數(shù)據(jù)評估了它們的染色質(zhì)狀態(tài)。
我們對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)使用了chromHMM狀態(tài)分析，HUVEC是與肺動脈內(nèi)皮細胞最相似的細胞系。正如對活性標記的預測，發(fā)現(xiàn)在測序結(jié)果中H3K27ac的peaks主要落在活性調(diào)控區(qū)域(包括啟動子和增強子)，而很少在異染色質(zhì)中(圖1h，補充圖1H)。
此外，PAH患者PAECs中差異H3K27ac的peaks僅在活性增強子中富集(adjusted p-value (adj. p-val) < 1E ? 16; Odds Ratio (OR) = 4.4)，甚至在活性啟動子中輕度缺失(adj. p-val = 0.03; OR = 0.93; 圖1g)。
綜上所述，這些結(jié)果表明，盡管PAH患者和健康對照組的PAEC在基因表達方面相似，但它們擁有活性染色質(zhì)區(qū)域的大規(guī)模重塑，特別是在活性增強子上。這可能表明，當PAH患者PAECs仍處于內(nèi)皮狀態(tài)時，PAECs可能已經(jīng)準備好對外界刺激做出不同于健康細胞的反應(yīng)。
2.Differentially H3K27-acetylated regions are disease relevant.
為了描述差異修飾區(qū)域和與PAH相關(guān)的分子機制，作者對可能受差異H3K27乙酰化區(qū)域調(diào)控的基因進行了功能富集分析。
然而，與啟動子中差異修飾區(qū)域的輕度缺失一致，作者發(fā)現(xiàn)啟動子標記的差異peaks調(diào)控的基因沒有被富集到特定GO通路，只有少數(shù)非常廣泛的H3K27-ac標記啟動子peaks調(diào)控的基因富集到了幾條內(nèi)皮增殖分化相關(guān)的通路(補充圖2A)。
因此，由于差異的H3K27ac peaks富集在增強子，我們必須設(shè)計一種策略，將H3K27ac調(diào)節(jié)元件與其靶標基因聯(lián)系起來。
隨后作者用CTCF作為錨定因子，通過成對末端標簽測序(CHIA-PET)對來自健康供者的肺動脈內(nèi)皮細胞中的染色質(zhì)相互作用進行了分析。得到的數(shù)據(jù)質(zhì)量高于ENCODE標準，與ENCODE CHIA-PET(補充圖2B)的范圍相似。共產(chǎn)生了21,805個loops，平均大小為283.7 kb(圖2a)，每個loop平均包含2個基因和25個H3K27ac峰(補充圖2C)。
作者觀察到CHIA-PET分析得到的loop中的H3K27ac peaks表現(xiàn)為一種高度協(xié)調(diào)的方式：在患者和對照組之間要么全部上調(diào)，要么全部下調(diào)(圖2b)。這種與PAH相關(guān)的染色質(zhì)變化在整個CTCF loop上的協(xié)同作用表明，它們可能作為獨立的調(diào)控元件在PAH發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。因此，也說明不需要增強子-啟動子的直接接觸，而是尋找可以使其高度協(xié)調(diào)的loops，或稱之為染色質(zhì)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(CRD)，可作為搜索增強子-靶基因相互作用的基礎(chǔ)。那么怎么去識別這種loops（CRD）呢？使用CHIA-PET loops兩個邊界上的H3K27ac信號的相關(guān)性作為該loops的協(xié)調(diào)強度的替代指標，假設(shè)如果一個loop的最遠位置的H3K27ac peak是相關(guān)的，那么中間的所有peak也將是相關(guān)的。
Define of CRD
當邊界H3K27ac峰與p值<0.05呈正相關(guān)時，loops被定義為CRD(圖2C)。最近在淋巴母細胞系[13]中也提出了類似的CRDs概念。
作為統(tǒng)計驗證，結(jié)果顯示負相關(guān)的p值分布沒有信號，而正相關(guān)在低p值時被富集(圖2d)。
然后，為了將基因與其特定的調(diào)控元件(增強子、啟動子)聯(lián)系起來，作者利用每個CRD中每個基因-peaks對的H3K27ac信號與RNA表達之間的Pearson相關(guān)性，并將正相關(guān)(p值為0.05)定義為調(diào)控、增強子-基因和啟動子-基因的相互作用，假定增強子和基因表達應(yīng)該是正相關(guān)的。
作者發(fā)現(xiàn)了更多的正相關(guān)信號，而負相關(guān)和隨機遺傳peaks鏈接的p值分布顯示沒有信號(圖2e)。
每個基因的增強子數(shù)量，被定義為與基因表達相關(guān)的H3K27ac峰，在CRD中比非CRD 中l(wèi)oops比例高，從而驗證了我們的假設(shè)(圖2f，補充圖2C，d)。
CRD內(nèi)的基因示例如圖2g和補充圖2E所示。
為了評估CRD的生物學意義，我們對CRD中與不同活性元件相關(guān)的基因進行了GO富集分析，并將其與非CRD 中l(wèi)oop相關(guān)的基因的GO分析進行了比較。
對于與CRD相關(guān)的基因，我們發(fā)現(xiàn)與PAH相關(guān)的內(nèi)皮生物學和過程有很強的富集性，如“內(nèi)皮細胞增殖”(adj. p-value = 0.03, OR = 4.5)和“內(nèi)皮細胞遷移”(adj. p-value = 0.03, OR = 3.8；圖2H)，而對于非CRD連鎖基因，沒有GO terms顯著富集。
這突出了CRD對于研究增強子-基因調(diào)控相互作用的生物學相關(guān)性。
總體而言，這些結(jié)果表明，通過CRD將基因與PAH中不同活性的增強子聯(lián)系起來，捕獲了預期的疾病相關(guān)和細胞類型特異性信號，并說明了將增強子與其目標基因聯(lián)系起來對理解疾病機制的重要性。
同時，發(fā)現(xiàn)這些內(nèi)皮細胞和PAH特異的功能，證明了我們的數(shù)據(jù)和分析方法的適用性，可以更多地了解PAH涉及的病理生物學。
4.Known PAH TFs are differentially active in PAH vs controls.
考慮到CRD內(nèi)內(nèi)皮功能和疾病特異性GO通路的不同活性區(qū)域的強烈富集，作者想更深入挖掘這些富集的分子通路的相關(guān)機制。
根據(jù)之前一項研究的結(jié)果，作者發(fā)現(xiàn)調(diào)控組蛋白修飾水平的遺傳變異通常位于TF結(jié)合位點內(nèi)[14]，因此作者提出一個假設(shè)：H3K27ac信號的差異是由一組特定的與疾病相關(guān)的TF驅(qū)動的。并且他們最近開發(fā)一個軟件diffTF的工具，并正式提出了這一想法，該工具基于兩組樣本之間的全基因組H3K27ac信號來估計差異TF活性[8]。
簡而言之，diffTF將H3K27ac信號的差異聚集在給定TF的所有假定結(jié)合位點附近，作為其差異活性的估計(見方法，補充圖3A，B)。在這里，我們應(yīng)用diffTF來量化PAH患者和對照組之間在我們數(shù)據(jù)中PAECs表達的所有TF的差異活動。
總共，我們發(fā)現(xiàn)了318個差異活性因子(代表了640個測試基序中的339個；FDR 0.001；圖3a，補充數(shù)據(jù)3)。
有趣的是，當作者將TF分為激活因子和抑制因子時(在分類模式[8]中使用diffTF)，他們發(fā)現(xiàn)患者和對照之間的差異TF活性和差異表達之間總體上存在顯著的相關(guān)性(補充圖3B)。
這表明TF表達的微小變化可以導致可檢測到的活性差異，這可能是由于H3K27ac信號在所有結(jié)合位點上的聚集所導致的[8]。
總而言之，在之前與PAH相關(guān)的20個TF中(編譯自https://monarchinitiative.org, https:// www.opentargets.org/, and ref. 15見方法；補充數(shù)據(jù)4)，16個被鑒定為差異活性TF，并且它們在差異活性TF中被強烈富集，而不管用于定義差異活性TF的閾值如何(圖3b)。
這表明我們評估TF活性的方法對于識別潛在的重要疾病驅(qū)動因素TF是可靠且靈敏的。SOX17，最近才被確認為PAH相關(guān)TF[7,16]在我們的PAH患者中也有顯著的缺失調(diào)節(jié)(補充數(shù)據(jù)4)。
一些TF(17個代表18個基序；圖3a)顯示出比已知的PAH-TF更強的PAH和對照之間的差異活性，這表明它們可能是導致該疾病的新候選調(diào)控因子。這些新發(fā)現(xiàn)的TF包括AP1復合體(BATF、FOSL1、JUN、JUND、FOSL2以及ATF1和ATF7，它們都有相似的結(jié)合位點，因此應(yīng)該被認為是無法區(qū)分的)，RFX家族的成員(RFX3、RFX4，又是相似的基序)，CREB5和E4F1在患者中活性更高，以及ARID3A，F(xiàn)OX家族的成員(FOXL1，F(xiàn)OXG1，F(xiàn)OXJ3，也是類似的。
AP1復合體是一種已知的促炎因子[17]，鑒于作者以往的發(fā)現(xiàn)，炎癥在PAH[18,19]中扮演著重要的角色，因此特別令人感興趣。類似地，E4F1和ARID3A已被證明與p53[20,21]的特定功能相互作用與激活，最近作者研究發(fā)現(xiàn)，在與炎癥相關(guān)的過程中，當缺失BMPR2時，p53特異性上調(diào)。CREB5已被認為是肺組織中的一個缺氧反應(yīng)基因[23]，其活性增強可能是疾病marker。RFX家族的轉(zhuǎn)鐵蛋白長期以來被認為與膠原的抑制有關(guān)[24]，而膠原又是一個已知的PAH相關(guān)基因(補充數(shù)據(jù)4)。最后，TBX4與TBX3具有高度相似的結(jié)合位點，其突變與兒童期發(fā)病的PAH有關(guān)[25]。這些例子表明，許多新預測的PAH-TF可能確實在發(fā)病機制中發(fā)揮了作用，并為進一步研究提供了重要的研究基礎(chǔ)。
4.Gene regulatory network and PAH-specific TFs highlight PAH biology.
下一步作者想要研究在PAH中受不同活性TF調(diào)控的靶基因。
為此，作者試圖建立一個PAH特異的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將TF與它們的靶基因聯(lián)系起來。
前面，作者已經(jīng)定義了基因和它們的增強子之間的聯(lián)系(圖2c)，所以現(xiàn)在只需要把TF與它們調(diào)節(jié)的調(diào)控元件聯(lián)系起來。
為此，作者設(shè)計了一種基于相關(guān)性的方法，如果(I)調(diào)控元件具有假定的TF結(jié)合位點，并且(II)與TF的表達水平顯著相關(guān)(正或負，反映激活因子和抑制因子)，則將TF與其靶調(diào)控元件聯(lián)系起來(圖4a)。
這假設(shè)TF表達的任何變化都應(yīng)該導致它正在調(diào)控的增強子和啟動子的活性的變化。
注意，該方法基于不同個體的TF表達和增強子信號的協(xié)變，并且與條件之間的差異表達/信號無關(guān)。
為了估計TF-peak的FDR，我們使用TF與不包含其motifs的峰的相關(guān)性作為背景來計算經(jīng)驗FDR。我們選擇20%的FDR作為界限，因為這似乎可以最大化“一致”交互的比例，從而一致被定義為TF的活動和它的目標peak沿著相同的方向進行的交互(圖4b)。值得注意的是，我們觀察到<20%的增強子與鄰近的基因相關(guān)(就到TSS的距離而言)，這再次強調(diào)了細胞類型特異的基因-增強子互作的重要性(圖4c)。
為了專注于解決疾病特異性的相互作用，作者選擇了由上面獲得的假定的PAH-TFs調(diào)控的子網(wǎng)絡(luò)。一個PAH特異的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括116個TFs，1880個目標基因和5342個相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖4d-f，補充數(shù)據(jù)5)。為了給網(wǎng)絡(luò)分配方向性，作者使用了基于Motif的diffTF計算的TF活性，還使用了CHIP-seq數(shù)據(jù)(參見方法)。TFs在基序和芯片序列數(shù)據(jù)之間的方向性不一致，但在至少一項分析中具有顯著性，被標記為“混合證據(jù)”。然后，這個網(wǎng)絡(luò)被用來查詢特定基因集合之間的調(diào)控關(guān)系。
作為第一個例子，我們可視化驗證了涉及先前已知的PAH相關(guān)TF的調(diào)控相互作用(圖4g，補充數(shù)據(jù)4)。
在306個已知的PAH相關(guān)基因中，有209個在我們的數(shù)據(jù)中表達，其中我們的GRN覆蓋了9個TF和45個靶基因。
最后作者發(fā)現(xiàn)這些基因群分為一個由GATA6和SP1、SP2和SP4主導的主要調(diào)控簇，以及受STAT4、ERG和THRB等調(diào)控的幾個較小的調(diào)控簇。
這表明，雖然有不同的調(diào)控途徑受到影響，但許多已知的PAH基因參與了同一級聯(lián)調(diào)控。
為了評估基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的生物學意義，作者對目的基因進行了GO富集分析，以所有表達的基因為背景，排除了TF。
我們發(fā)現(xiàn)超過250個GO terms在目標基因中顯著富集(補充數(shù)據(jù)6；圖5a中顯示的子集)。
許多富集的生物學過程與內(nèi)皮生物學有關(guān)，也與PAH有關(guān)。包括細胞遷移和管狀形態(tài)發(fā)生(“regulation of cell migration” (OR = 1.4, adj. p-val = 4.1e-3) and “regulation of tube size” (OR = 2.5, adj. p-val = 0.011；補充數(shù)據(jù)6))，它們在PAH來源的內(nèi)皮細胞中是下調(diào)的。
其他通路，如“細胞對皮質(zhì)類固醇刺激的反應(yīng)”(OR = 3.2, adj. p-val = 0.02)和“血管收縮調(diào)節(jié)”(OR = 3.7, adj. p-val = 0.016)可能是疾病和患者在肺移植前接受的治療的結(jié)果，因為所有患者都接受了某種血管擴張劑藥物的治療(圖5a，補充數(shù)據(jù)1)。
隨后作者確定的最具體的GO是“SMAD蛋白復合物assembly”，這一過程受到導致HPAH的BMPR2突變的影響(圖5B)。
總體而言，這些terms表明，我們的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，由PAH患者不同活性的TF驅(qū)動，能夠恢復預期的生物學過程，從而驗證了該方法。
接下來，作者使用PAH調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來揭示疾病發(fā)生機制的過程。在PAH特異性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，最富集的GO term是“平滑肌細胞分化的正調(diào)控(positive regulation of smooth muscle cell differentiation)”，為此，作者確定了10個基因中的7個(OR = 17, adj. p-val = 1.9e-3；圖5a,c)。
他們還發(fā)現(xiàn)了其他與肌肉生物學相關(guān)的生物過程，如“上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化”和“中胚層發(fā)育”，這些都是富集程度較高的通路(圖5c)。向GRN查詢這些GO中TF活性的方向性，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)調(diào)節(jié)它們的TF在PAH中更活躍，從而表明這些通路在PAH中上調(diào)。隨著“細胞增殖”的增加(OR = 1.4, adj. p-val = 4.9e-3)這可能提示增殖的內(nèi)皮細胞開始分化為平滑肌樣細胞的機制。這是如何發(fā)生的一個線索來自term“對轉(zhuǎn)化生長因子β的反應(yīng)”(OR = 1.8, adj. p-val = 0.045)。提示內(nèi)皮細胞對生長因子刺激的異常反應(yīng)可能導致細胞增殖和EndMT，并可能最終促進PAH中典型的平滑肌細胞過度增殖[26]。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)表明，轉(zhuǎn)化生長因子家族TGFβ1，也包括在平滑肌分化GO term中，受SP家族(SP1, SP2, SP4)的TF控制，這些TF在肺動脈高壓患者中具有不同的活性(圖5d)。更重要的是，作者發(fā)現(xiàn)通過TGFβ激活的SMAD2 TF在肺動脈高壓中具有很強的活性(圖5e)，因此提示肺動脈高壓患者內(nèi)皮細胞中TGFβ通路的調(diào)控缺失與疾病發(fā)生相關(guān)。它還提示與炎癥(SP家族)、信號轉(zhuǎn)導(SMADS)和EndMT(SNAI1)相關(guān)的TF之間存在以前未知的聯(lián)系。
總之，我們的數(shù)據(jù)表明，肺動脈高壓患者活躍的染色質(zhì)景觀在調(diào)節(jié)平滑肌細胞分化相關(guān)基因的增強子上發(fā)生了特異性的改變，并可能對TGFβ信號做出異常反應(yīng)。這也解釋了RNA和H3K27ac標記之間缺乏相關(guān)性的原因。因此，我們預測，在內(nèi)皮生長或信號因子的刺激下，這些靶基因中的一些在PAH患者和對照組中的表達反應(yīng)將顯著不同。
5.RNA response to growth factor reflects steady state H3K27ac.
為了驗證PAH患者PAECs中的增強子在啟動特定基因以對生長因子刺激做出異常反應(yīng)的假設(shè)，作者在一組預測在PAH患者中被不同啟動的基因中，測量了PAECs中相關(guān)的三個刺激的反應(yīng)。這些基因被選擇來代表發(fā)現(xiàn)富集在PAH GRN中的不同過程，并且需要(在作者的GRN中)連接到一個不同的H3K27-acetylated peak。
具體地說，我們選擇了NOS3和HTR1B(血管系統(tǒng))，TSC22D1(基本轉(zhuǎn)錄過程)，YAP1和DKK1(中胚層發(fā)育)，NFE2L2(刺激反應(yīng))和TGFβ受體2(TGFβ的直接靶標)。
我們使用了8個肺動脈內(nèi)皮細胞株-4個來自患者(2個IPAH和2個HPAH)和4個來自對照組-并使它們受到三種與內(nèi)皮細胞相關(guān)的不同生長因子/信號分子的刺激：血管內(nèi)皮生長因子(VEGF10 ng/ml)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ；10 ng/ml)和5-羥色胺(serotonin，10uM)，每種刺激24小時，然后我們對選定的基因進行qPCR，比較PAH和對照組的表達。
正如從全局RNA-Seq數(shù)據(jù)中結(jié)果的那樣，在未刺激的肺動脈內(nèi)皮細胞中，患者和對照組之間沒有檢測到顯著變化(圖6a)。
然而，我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因在至少一種刺激下在患者和對照組之間表現(xiàn)出顯著的差異(補充圖4A)。
重要的是，當比較PAH和對照組時，我們發(fā)現(xiàn)基線時增強子活性(H3K27ac)的變化與內(nèi)皮信號下其靶基因表達的變化之間存在很強的相關(guān)性(圖6a)。
這證實了這樣的觀點，即這些基因正被增強子激活，在PAH患者中以異常的方式做出反應(yīng)，從而可能導致異常生長或分化。對于TGF-β刺激，我們發(fā)現(xiàn)差異調(diào)控基因的增強子在刺激時變得異常活躍(圖6b)。
為了擴大這些觀察到的功能重要性，作者的結(jié)果還表明，在每種刺激中，一些基因的蛋白質(zhì)水平(用WB測量)與mRNA水平一致(圖6c)。對于受磷酸化高度調(diào)控的YAP1，作者還通過實驗驗證了磷酸化形式根據(jù)其RNA水平的變化(補充圖4B)。
下面的例子可以作為在PAH疾病機制背景下解釋數(shù)據(jù)的概念的證明：
首先，VEGF通常誘導NOS3[27]。在PAH-PAECs中，其增強子與對照-PAECs相比H3K27ac信號減少了。
同時NOS3 mRNA和蛋白對VEGF的反應(yīng)僅在對照組肺動脈內(nèi)皮細胞中增強。
其次，5-羥色胺通常通過HTR1B受體C(HTR1BRC)刺激血管生成。
然而，在PAH-PAEC中，HTR1BRC的增強子顯示H3K27ac信號減弱，似乎可以使細胞對抗5-羥色胺刺激后HTR1BRC mRNA和蛋白的誘導，從而提供了另一種破壞PAH血管生成的方式，這與5-羥色胺反應(yīng)中NOS3的減少是一致的。或者，NOS3增強劑子H3K27ac標記的減少可能會改變其在PAH中的反應(yīng)。
第三，YAP1促進內(nèi)皮細胞的血管生成[28]，但是YAP1在內(nèi)皮細胞中不受TGFβ的調(diào)節(jié)[29]。在此，TGFβ對肺動脈高壓肺動脈內(nèi)皮細胞YAP1和NOS3表達的上調(diào)也可能是這些細胞血管生成受損的原因。
最后，新的TF，如NFE2L2和TSC22D1，似乎被TGFβ異常上調(diào)，可能與干擾這一途徑的新機制有關(guān)。因此，H3K27ac標記幫助我們發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮再生中重要的新通路和效應(yīng)器，以響應(yīng)在疾病(如肺動脈高壓)中受損的刺激。
總而言之，這些實驗驗證了作者的預測，即PAH患者的內(nèi)皮細胞對生長因子刺激的反應(yīng)方式與健康對照組明顯不同，這一機制可能涉及增強子啟動。
綜上所述，本研究結(jié)果為肺動脈高壓的表觀遺傳學基礎(chǔ)提供了AP1、TGFβ、5-羥色胺和VEGF信號的異常，這些信號共同導致炎癥、異常的血管生成和EndMT，以及平滑肌細胞增殖的傾向，這些都是肺動脈高壓的特征。此外，結(jié)果表明，潛在的治療方法不僅應(yīng)該考慮它們對細胞表面受體或信號通路的影響，而且應(yīng)該考慮它們是否逆轉(zhuǎn)了異常的表觀遺傳的影響。
小結(jié)
環(huán)境和表觀遺傳因素往往在多基因疾病中起重要作用。
作者從患者和對照組(n=19)的肺組織中獲得肺動脈內(nèi)皮細胞(PAECs)，并進行染色質(zhì)、轉(zhuǎn)錄和相互作用分析。
作者觀察到PAH-PAEC中活性增強子的廣泛重構(gòu)，并鑒定了數(shù)百個不同活性的TF，但在穩(wěn)定狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄變化很小。
設(shè)計了一個疾病特異性的增強子-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并預測PAH患者PAECs中的啟動增強子被不同活性的TF激活，導致其對內(nèi)皮信號的異常反應(yīng)，這可能導致血管生成障礙和內(nèi)皮到間質(zhì)的轉(zhuǎn)變。
在體外實驗驗證了在轉(zhuǎn)化生長因子-β、血管內(nèi)皮生長因子或5-羥色胺刺激的肺動脈內(nèi)皮細胞中選擇靶基因的預測。
本研究強調(diào)了染色質(zhì)狀態(tài)和活性增強子在疾病相關(guān)的PAH細胞類型中的作用。
討論
本研究表明，PAH患者的小肺動脈內(nèi)皮細胞(PAECs)在穩(wěn)態(tài)時表現(xiàn)出增強子的重塑，但沒有顯示任何顯著差異表達的基因。這一明顯的矛盾使作者提出科學假設(shè)：增強子可能啟動PAH中的PAECs，使其對內(nèi)皮信號做出異常反應(yīng)，作者在實驗上通過一些基因證實了這一點。
使用染色質(zhì)構(gòu)象和基于相關(guān)性的方法將基因與其近端和遠端的調(diào)控元件聯(lián)系起來，作者發(fā)現(xiàn)了特異的內(nèi)皮和PAH相關(guān)過程，表明PAH中的PAEC在正常的內(nèi)皮信號作用下向內(nèi)皮到間質(zhì)的轉(zhuǎn)變啟動。這突出了將基因與其遠端調(diào)控元件聯(lián)系起來以揭示生物功能的重要性。
通過使用diffTF[8]將H3K27ac信號轉(zhuǎn)換為活性TF分布，我們在患者和對照組之間識別出了大量不同活性的TF，包括幾乎所有先前已知的PAH相關(guān)TF。
結(jié)合RNA, ChIA-PET和H3K27ac數(shù)據(jù)，作者設(shè)計了一種方法來生成基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)能夠捕獲與疾病相關(guān)的生物學過程。除了生物學上的關(guān)聯(lián)，這也表明(a)從供體肺中獲取并培養(yǎng)了幾代的細胞保持其調(diào)控狀態(tài)，潛在地編碼為表觀遺傳記憶，以及(b)本研究中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)方法能夠捕捉到重要的生物學功能。
作者注意到，其構(gòu)建的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是基于TF和調(diào)控元件之間的相互作用，這些元件在不同的個體之間是不同的。
因此，我們不太可能找回高度保守和嚴格調(diào)控的過程，而是那些可能因個體而異的過程，因此可能在聚集在導致疾病的分子途徑上發(fā)揮作用。同時還注意到，使用CTCF-CHIA-PET作為調(diào)用染色質(zhì)調(diào)節(jié)域的基礎(chǔ)的一個缺陷是，將對任何沒有被CTCF劃定的基因loop失去觀察力。
通過使用疾病特異性轉(zhuǎn)錄因子探索這個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，作者在top GO term中確定了與平滑肌細胞分化相關(guān)的過程。這一點特別有趣，因為作者之前的發(fā)現(xiàn)表明，PAEC中BMPR2活性的降低促進了EndMT[26]。然而，這一先前的發(fā)現(xiàn)是對BMPR2下調(diào)的特異性反應(yīng)，并由HMGA1和Slug介導。
在本次研究的網(wǎng)絡(luò)分析中，作者發(fā)現(xiàn)，overall regulatory state可能會推動細胞走向EndMT。這一點特別有趣，因為這次并沒有發(fā)現(xiàn)BMPR2的顯著下調(diào)。Slug和HMGA1是我們網(wǎng)絡(luò)中的靶基因，可能有助于EndMT作為PAH過程的富集。
最后，盡管沒有發(fā)現(xiàn)任何差異表達的基因，PAECs中的H3K27ac水平對選擇的一組基因的內(nèi)皮信號因子的表達變化具有很高的預測性。
這表明，雖然這些從肺動脈最內(nèi)皮層分離的細胞仍然具有內(nèi)皮命運，但它們確實顯示出向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化為平滑肌細胞的啟動。
這種轉(zhuǎn)變可能是由炎癥以及5-羥色胺和TGFβ等信號分子觸發(fā)的。EndMT導致抑制平滑肌細胞增殖的內(nèi)皮因子缺失，從而導致PAH患者增生的平滑肌細胞擴張的新生內(nèi)膜堵塞血管腔。
總而言之，本研究提出了一個大的框架，用于在增強子介導的基因網(wǎng)絡(luò)中集成多個組學數(shù)據(jù)，允許識別驅(qū)動疾病特定途徑的基因，并對疾病機制提供見解。
它表明，穩(wěn)態(tài)表達分析僅限于機制涉及對刺激的異常反應(yīng)的系統(tǒng)。考慮到增強子，特別是活性標記H3K27ac的增強子，可能會導致僅靠基因表達或啟動子分析無法獲得的見解。看看H3K27ac標記的增強子是否可以在其他系統(tǒng)中充當啟動因子，從而在某種程度上為穩(wěn)態(tài)研究增加了一個更動態(tài)的視角，這將是一個有趣的事情。
Data availability
The raw sequencing data are available at the Gene Expression Omnibus (GEO) data repository under the accession number GSE126325. Chromatin modififications profifiling data have been deposited under the accession number GSE126322. RNA-Seq data have been deposited under the accession number GSE126262. Chromatin interaction profifiling (ChIA-PET) data mediated by CTCF have been deposited under the accession number GSE139234. The source data underlying Figs. 1f, 2a, b, d, e, h, 6c and Supplementary Figs. 2a, 4a, b are provided as a Source Data fifile.
Code availability
Code is available upon request from the corresponding author judith.zaugg@embl.de.
Received: 4 March 2019; Accepted: 13 March 2020;
References
\1. Morrell, N. W. et al. Genetics and genomics of pulmonary arterial
hypertension. Eur. Respir. J. 53, 1801899 (2019).
\2. Lau, E. M. T., Giannoulatou, E., Celermajer, D. S. & Humbert, M.
Epidemiology and treatment of pulmonary arterial hypertension. Nat. Rev.
Cardiol. 14, 603–614 (2017).
\3. Benza, R. L. et al. An evaluation of long-term survival from time of diagnosis
in pulmonary arterial hypertension from the REVEAL Registry. Chest 142,
448–456 (2012).
\4. Rabinovitch, M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. J.
Clin. Invest. 122, 4306–4313 (2012).
\5. Simonneau, G. et al. Updated clinical classifification of pulmonary
hypertension. J. Am. Coll. Cardiol. 62, D34–D41 (2013).
\6. Machado, R. D. et al. Pulmonary arterial hypertension: a current perspective
on established and emerging molecular genetic defects. Hum. Mutat. 36,
1113–1127 (2015).
\7. Gr?f, S. et al. Identifification of rare sequence variation underlying heritable
pulmonary arterial hypertension. Nat. Commun. 9, 1416 (2018).
\8. Berest, I. et al. Quantifification of differential transcription factor activity and
multiomics-based classifification into activators and repressors: diffTF. Cell Rep.
29, 3147–3159 (2019). e12.
\9. Rhodes, C. J. et al. RNA sequencing analysis detection of a novel pathway of
endothelial dysfunction in pulmonary arterial hypertension. Am. J. Respir.
Crit. Care Med. 192, 356–366 (2015).
\10. Sa, S. et al. Induced pluripotent stem cell model of pulmonary arterial
hypertension reveals novel gene expression and patient specifificity. Am. J.
Respir. Crit. Care Med. 195, 930–941 (2017).
\11. Gu, M. et al. Patient-specifific iPSC-derived endothelial cells uncover pathways
that protect against pulmonary hypertension in BMPR2 mutation carriers.
Cell Stem Cell 20, 490–504 (2017).
\12. Roadmap Epigenomics, Consortium et al. Integrative analysis of 111 reference
human epigenomes. Nature 518, 317–330 (2015).
\13. Delaneau, O. et al. Chromatin three-dimensional interactions mediate genetic
effects on gene expression. Science 364, eaat8266 (2019).
\14. Grubert, F. et al. Genetic control of chromatin states in humans involves local
and distal chromosomal interactions. Cell 162, 1051–1065 (2015).
\15. Garcia-Rivas, G., Jerjes-Sánchez, C., Rodriguez, D., Garcia-Pelaez, J. &
Trevino, V. A systematic review of genetic mutations in pulmonary arterial
hypertension. BMC Med. Genet. 18, 82 (2017).
\16. Rhodes, C. J. et al. Genetic determinants of risk in pulmonary arterial
hypertension: international genome-wide association studies and meta?
analysis. Lancet Respir. Med. 7, 227–238 (2019).
\17. Angel, P. & Karin, M. The role of Jun, Fos and the AP-1 complex in cell?
proliferation and transformation. Biochim. Biophys. Acta 1072, 129–157
(1991).
\18. Rabinovitch, M., Guignabert, C., Humbert, M. & Nicolls, M. R. Inflflammation
and immunity in the pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. Circ.
Res. 115, 165–175 (2014).
\19. Boucherat, O. et al. The cancer theory of pulmonary arterial hypertension.
Pulm. Circ. 7, 285–299 (2017).
\20. Le Cam, L. et al. E4F1 is an atypical ubiquitin ligase that modulates p53
effector functions independently of degradation. Cell 127, 775–788 (2006).
\21. Lestari, W. et al. Cooperation between ARID3A and p53 in the transcriptional
activation of p21WAF1 in response to DNA damage. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 417, 710–716 (2012).
\22. Diebold, I. et al. BMPR2 preserves mitochondrial function and DNA during
reoxygenation to promote endothelial cell survival and reverse pulmonary
hypertension. Cell Metab. 21, 596–608 (2015).
\23. Leonard, M. O. et al. Hypoxia selectively activates the CREB family of
transcription factors in the in vivo lung. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178,
977–983 (2008).
\24. Ponticos, M. & Smith, B. D. Extracellular matrix synthesis in vascular disease:
hypertension, and atherosclerosis. J. Biomed. Res. 28, 25–39 (2014).
\25. Kerstjens-Frederikse, W. S. et al. TBX4 mutations (small patella syndrome) are
associated with childhood-onset pulmonary arterial hypertension. J. Med.
Genet. 50, 500–506 (2013).
\26. Hopper, R. K. et al. In pulmonary arterial hypertension, reduced BMPR2
promotes endothelial-to-mesenchymal transition via HMGA1 and its target
slug. Circulation 133, 1783–1794 (2016).
\27. Chen, Y., Medhora, M., Falck, J. R., Pritchard, K. A. & Jacobs, E. R.
Mechanisms of activation of eNOS by 20-HETE and VEGF in bovine
pulmonary artery endothelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291,
L378–L385 (2006).
\28. He, J. et al. Yes-associated protein promotes angiogenesis via signal transducer
and activator of transcription 3 in endothelial cells. Circ. Res. 122, 591–605
(2018).
\29. Shoeibi, S., Mozdziak, P. & Mohammadi, S. Important signals regulating
coronary artery angiogenesis. Microvasc. Res. 117, 1–9 (2018).
\30. Mahler, G. J., Farrar, E. J. & Butcher, J. T. Inflflammatory cytokines promote
mesenchymal transformation in embryonic and adult valve endothelial cells.
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 121–130 (2013).
\31. Kasowski, M. et al. Extensive variation in chromatin states across humans.
Science 342, 750–752 (2013).
\32. Landt, S. G. et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and
modENCODE consortia. Genome Res. 22, 1813–1831 (2012).
\33. Fullwood, M. J., Han, Y., Wei, C.-L., Ruan, X. & Ruan, Y. Chromatin
interaction analysis using paired-end tag sequencing. Curr. Protoc. Mol. Biol.
Chapter 21, 1–25 (2010).
\34. Heidari, N. et al. Genome-wide map of regulatory interactions in the human
genome. Genome Res. 24, 1905–1917 (2014).
\35. Phanstiel, D. H., Boyle, A. P., Heidari, N. & Snyder, M. P. Mango: a bias?
correcting ChIA-PET analysis pipeline. Bioinformatics 31, 3092–3098 (2015).
\36. Love, M. I., Huber, W. & Anders, S. Moderated estimation of fold change and
dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15, 550 (2014).
\37. Bolger, A. M., Lohse, M. & Usadel, B. Trimmomatic: a flflexible trimmer for
Illumina sequence data. Bioinformatics 30, 2114–2120 (2014).
\38. Li, H. & Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows?
Wheeler transform. Bioinformatics 25, 1754–1760 (2009).
\39. Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R. & de Santiago, I. Impact of
artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data.
Front. Genet. 5, 75 (2014).
\40. Lun, A. T. L. & Smyth, G. K. csaw: a Bioconductor package for differential
binding analysis of ChIP-seq data using sliding windows. Nucleic Acids Res.
44, e45 (2016).
\41. Kulakovskiy, I. V. et al. HOCOMOCO: towards a complete collection of
transcription factor binding models for human and mouse via large-scale
ChIP-Seq analysis. Nucleic Acids Res. 46, D252–D259 (2018).
\42. Gheorghe, M. et al. A map of direct TF-DNA interactions in the human
genome. Nucleic Acids Res. 47, e21 (2019).
