腫瘤突變負荷（Tumor Mutation Burden，TMB // Tumor Mutation Load（TML））是一種新發現的可量化的臨床指標，有望用來預測腫瘤對腫瘤免疫治療的反應。研究發現：TMB越高的病人，對腫瘤免疫治療的效果越好。
具體來說， TMB就是腫瘤組織每兆堿基中突變的總數。通俗的講，就是腫瘤基因的突變密度，也就是腫瘤基因組中平均有多少突變。想象一下，整個基因組就是一個龐大的密碼庫，一些密碼遁世望塵無所事事，一些密碼勤勤懇懇地掌管著你的細胞、組織的生老病死。
突變，就是說密碼在遺傳或環境等因素的作用下出現了變換，可能是A變成B，也可能少了C整個隊列都錯位等。正常人也有一定的突變，但一般數目相對較少且多數被修正，或者發生在那些無所事事無傷大雅的地方。
腫瘤的發生發展，很多時候和基因在重要的編碼序列發生突變相關。腫瘤突變負荷，TMB，就是這個密碼庫單位區域中發生錯誤的密碼總量。一定程度上可以理解成單位區域內發生變換的密碼總量越大，腫瘤突變負荷（TMB）越高，那么可能相應的腫瘤相關的致癌突變越多，每個腫瘤的個性就越突出，越不同于正常細胞。
我們的免疫系統就是志在清除異已，而腫瘤免疫治療的精髓就是通過各種方法喚起、加強機體的免疫系統對腫瘤的殺傷。這種情況下，腫瘤突變負荷越大，即TMB越高，腫瘤越個性迥異于正常，越容易成為腫瘤免疫的靶子，從而理論上講越有可能對免疫治療有效——說白了，突變越多的癌細胞，越不像正常細胞，越容易被免疫細胞發現。
正常細胞都是白旗飄飄宣告免戰，而腫瘤TMB越高，就意味著舉著越多的紅旗在白旗的海洋里招搖過世，隨時招致免疫細胞來炮轟。所以，TMB越高的腫瘤病人對于免疫反應的效果越好?，F在已知：高TMB可以幫助預測腫瘤免疫治療在肺癌、膀胱癌、黑色素瘤病人中的療效。
PD-1/PD-L1抗體在有大量TMB的肺癌中療效顯著優于低TMB的肺癌，前者的無進展生存時間是后者的4倍多！高TMB的膀胱癌患者，對PD-1/PD-L1抗體的反應更好。在接受CTLA-4抗體，免疫治療的黑色素瘤的病人，高TMB的病人和低TMB病人相比，總生存時間延長3.5年！大家可以看到TMB在預測腫瘤免疫的治療反應方面的喜人成果。
那么如何測定TMB呢？怎么知道腫瘤突變負荷的高低？現在的方法是全面的基因組分析，備選的方案有：全基因組測序、全外顯子測序和選擇性基因測序。因為是新興的預測指標，目前沒有統一的方式。對于現在很火熱的PD-1免疫抗體來說，有效率的問題一直不高，雖然有PD-L1陽性作為參考，但在1%，大于5%和大于50%三種情況下，也并不是正比關系；同樣由于對PD-L1檢測的免疫組化方法不同，表達標準也不一致。是否還有更適合的檢測指標能提高PD-1抗體的有效率呢？
TMB能夠預估免疫治療的療效
2017年ASCO年會有報道稱：高TMB的患者（腫瘤基因的突變密度高的患者），無疾病進展期 (PFS)相比化療的生存期長。研究發現：TMB越高的病人，對腫瘤免疫治療的效果越好?，F代醫學中發現腫瘤的發生發展，很多時候和基因在重要的編碼序列發生突變相關。腫瘤突變負荷（TMB），就是基因中發生錯誤的密碼總量。腫瘤突變負荷（TMB）越高，那么可能相應的腫瘤相關的致癌突變越多，每個腫瘤的個性就越突出，越不同于正常細胞。腫瘤免疫治療的原理就是通過加強機體免疫系統對腫瘤的識別和殺傷。而腫瘤突變負荷越大（TMB越高），突變越多的癌細胞，越不像正常細胞，越容易被免疫細胞發現。自然無法逃脫免疫系統的追殺?，F在已知：高TMB可以幫助預測腫瘤免疫治療在肺癌、膀胱癌、黑色素瘤病人中的療效。PD-1/PD-L1抗體在有大量TMB的肺癌中療效顯著優于低TMB的肺癌，前者的無進展生存時間是后者的4倍多！高TMB的膀胱癌患者，對PD-1/PD-L1抗體的反應更好。在接受CTLA-4抗體，免疫治療的黑色素瘤的病人，高TMB的病人和低TMB病人相比，總生存時間延長3.5年！
PD-L1
首先我們先了解一下什么是PD-L1，PD-L1是一種表達于細胞表面的蛋白，又稱B7-H1蛋白，是由CD274基因編輯表達。它可以與效應T細胞上的PD-1及B7.1結合，傳導免疫抑制信號，抑制免疫效應T細胞的活性。PD-L1在許多類型的細胞中表達，包括胎盤、血管內皮細胞、胰島細胞、肌肉、肝細胞、上皮細胞、間充質干細胞，以及B細胞，T細胞，樹突狀細胞，巨噬細胞，肥大細胞。而PD-L1在腫瘤細胞表面的表達則成為了腫瘤逃脫免疫細胞追殺造成腫瘤生長的驅動因素。
PD-L1在腫瘤細胞的表達機制有兩種，組成性廣泛（固有）表達和適應性聚焦表達。固有表達是因為致癌基因信號通路改變引起的PD-L1的組成性表達，表達恒定。適應性聚焦表達是在免疫細胞分泌的促炎癥因子如IFN-γ的作用下表達，是動態變化的。這兩種表達機制不排斥，PD-L1的固有表達可在炎癥因子作用下表達上調。
基于以上機理， PD-L1的檢測是基于細胞蛋白水平的檢測，因此臨床試驗中以免疫組化方法為主。也就是大家在手術或穿刺后取得的腫瘤組織進行切片染色，通常在病理報告中顯示。免疫組化是檢測蛋白表達的經典手法，其通過抗體著色后由病理醫師鏡下觀察根據著色深淺來評價表達情況。因此除了染色技術外，抗體的特異性也尤其重要。而目前我國PD-L1檢測比較混亂，一是染色技術及條件的不統一；二是染色的抗體多樣；三是病理評價標準尚未統一。這些都導致國內患者檢測PD-L1的價值減低。
截至到目前，FDA已經批準了4款PD-1/PD-L1抑制劑用于7類不同腫瘤的治療，下表列出批準的時間和基本適應癥（精準適應癥全稱請查閱FDA官方網站）。
目前市場上這四種單抗檢測是否具有可比性，是否可以通用？檢測技術是IHC，一種儀器是Ventana，一種是Dako，而且評價細胞有腫瘤細胞和腫瘤浸潤免疫細胞，因此在評價免疫治療時要考慮單抗藥物、檢測方法、cutoff值等信息?，F在，50%高表達僅限于默沙東的檢測方法，至于是否與其他方法通用，目前缺乏循證醫學證據。
羅氏單抗藥物是Atezolizumab，靶點PD-L1，PD-L1 ICH檢測使用Ventana SP142，評價的細胞是腫瘤細胞和腫瘤浸潤免疫細胞，cutoff值定為1%、5%、50%。III期OAK研究顯示，PD-L1高表達人群傾向于從Atezolizumab治療中獲得更大的OS獲益，而且隨著表達率的增高，獲益更大；在PD-L1陰性亞組中，Atezolizumab相比多西他賽未能提高ORR。
施貴寶的Nivolumab靶點PD-1，檢測使用Dako28-8，cutoff值是1%、5%。III期CheckMate057研究顯示，PD-L1的表達水平與非鱗NSCLC患者從Nivolumab治療的OS獲益呈正相關。III期CheckMate017研究顯示，Nivolumab在鱗癌患者中的療效與PD-L1的表達水平無關。
第三個是Pembrolizumab單抗，靶點PD-1，PD-L1IHC檢測使用Dako 22C3，評價的是腫瘤細胞，cutoff值是1%、50%。III期KEYNOTE010研究顯示，PD-L1高表達人群接受Pembrolizumab治療后死亡風險下降更多。PD-L1表達對Pembrolizumab至關重要，PD-L1強陽性的患者甚至可以一線使用。
如何定義表達率
PD-L1檢測受人詬病的地方之一是缺乏標準。已經獲批或正在研究中的抗PD-1治療，包括atezolizumab和durvalumab都有自己配套的PD-L1檢測。但問題是，每種檢測所用到的抗體和具體技術都不同，導致PD-L1陽性的定義只對應于藥企自己的標準。比如雖然所有的檢測都分析了腫瘤細胞的PD-L1染色情況，但atezolizumab同時需要評估免疫浸潤細胞的PD-L1狀態。針對檢測標準的問題，包括國際肺癌研究協會在內的多個國際組織都在努力推進不同PD-L1表達檢測技術分析，以期能夠提供不同檢測間可靠的精密度對比數據。
在臨床試驗中， Keytruda及opdivo定義了PD-L1表達的統計標準，主要以百分比為標尺，即在至少有100個腫瘤細胞的癌巢中，表達PD-L1的腫瘤細胞占癌巢腫瘤細胞的比例，因此出現了PD-L1表達的百分比之說。下圖即是PD-L1表達量1%、1%-49%、50%的不同鏡下圖，黃色為著色部位即表達PD-L1的細胞。（ABC為低倍鏡下，DEF為高倍鏡下）。
而atezolizumab治療NSCLC的臨床試驗中，他們將檢測點不只局限在腫瘤細胞的PD-L1表達上還同時評價了腫瘤環境中浸潤的免疫細胞上PD-L1的表達情況，即采用了TC及IC兩個標準，試驗結束，兩個預測指標對療效都有獨立預測價值。這主要基于體內的免疫細胞如調節T細胞也參與了免疫環境的調控。這也提示PD-L1的檢測存在很多分歧事宜。
1.3 PD-L1****檢測的問題與挑戰
PD-L1檢測存在的問題有：生物學方面，如瘤間及瘤內異質性，干預治療影響表達，以及細胞類型、染色部位等；檢測技術方面，如不同的檢測抗體和平臺，不同的閾值；組織來源方面，組織類型，原發部位與轉移灶，細胞學標本，標本質量等。這些可能會干擾PD-L1的檢測結果，需要大量臨床研究進行證實。
美國AACR、IASLC和4家公司聯合制定了藍印計劃，目的就是比對四種單抗的檢測結果。藍印計劃在39個NSCLC標本比較4個試劑檢測的結果，在染色方面，28-8、22C3、SP263顯示出相似的腫瘤細胞陽性染色百分比，SP142染色陽性的腫瘤細胞較少；4種試劑在免疫細胞的染色上一致性較大；在臨床診斷方面，4種試劑完全一致的只占19%。
德國的一致性研究顯示，4種試劑在腫瘤細胞染色之間的一致性較高，免疫細胞色一致性較差。
AZ比較研究對500例標本比較了28-8、SP263和22C3的腫瘤細胞染色，結果顯示3種試劑之間的一致性較高。
2016年ESMO報告了迄今最大樣本量的NSCLC PD-L1檢測數據，包括4784例NSCLC，研究得出4項結論：鱗癌和腺癌的表達分布相似；經治和初治人群的表達分布相似；原發部位和轉移灶的表達分布相似；新鮮標本和存檔標本的表達分布相似。
FDA獲批的PD-1/PD-L1抑制劑對PD-L1的檢測要求，對于不同腫瘤根據不同的循證醫學證據批準，如Nivolumab二線治療無需PD-L1表達檢測，但建議補充診斷，Atezolizumab二線治療也不需要PD-L1表達檢測，Pembrolizumab一線治療PD-L1≥50%，二線治療≥1%。
2****腫瘤突變負荷
從已經批準的適應癥和關鍵臨床研究提供的證據來看，PD-L1的表達是否可以指導臨床用藥，選擇獲益人群，結論目前還不一致，這從另外一個側面提示PD-L1表達還不是一個完美的bio-marker。研究較多的潛在bio-marker 有腫瘤突變負荷（tumor mutation burden, TMB）、微衛星高度不穩定（microsatelliteinstability-high, MSI-H）和錯配基因修復缺失（mismatch-repair deficiency，MMR），這些潛在的bio-marker又指向一個共同點突變相關新抗原（mutation-associated neoantigen）。抗CTLA-4在惡性黑色素瘤的研究與抗PD-1在NSCLC的研究進一步說明識別突變相關新抗原是引起自身抗腫瘤免疫反應的核心要素。
2.1****背景知識
腫瘤突變負荷（TMB）涉及到兩個重要概念germline mutation（種系突變或胚系突變）和somatic mutation（體細胞突變），來自BioNinjia的圖解一目了然地詮釋二者的關系與區別。胚系突變來自上一代，可以遺傳，比如血友病，鐮刀細胞貧血等。
Somatic突變為獲得性突變，在誘變劑的影響下發生突變，可表現在RNA和蛋白水平，產生的新抗原（或新表位）、蛋白片段、肽段等被自身免疫系統識別為非自我（non-self）抗原，激活T細胞，引起免疫反應。
體細胞突變可能受到外源性誘變因素的影響，比如肺癌中煙草（吸煙）誘導的C→A的突變。惡性黑色素瘤中，紫外線照射引起的C→T的突變。內源性因素引起的突變可以是DNA錯配修復突變，比如結直腸癌和食管癌中的MSI（微衛星不穩定）。在實體腫瘤中，95%的突變為單個堿基的替換，造成的非同義突變（一個核苷酸突變改變一個蛋白的氨基酸順序），錯義突變（非同義點突變，單個核苷酸改變導致一個密碼子編碼一個不同的氨基酸）和無義突變（非同義點突變使一個密碼子變為終止密碼子引起多肽鏈合成提前終止），共同構成了體細胞非同義突變的基本要素。
2.2 TMB****定義：
全基因組中計入胚系DNA變體后體細胞突變數目。比如Lawrence,MS團隊在Nature上發表的研究中，將超過100個突變/Mb稱之為高TMB。
2.3****臨床研究
Tumor Mutation Burden 指導臨床研究并已經取得的成果，突變負荷越高，治療應答越好，有時腫瘤類型更復雜、腫瘤突變負荷更高的癌癥患者治療應答會更好，這聽起來可能有點不可思議。
抗PD1和抗程序性死亡配體（PD-L1）檢查點抑制劑可能有助于激活高腫瘤突變負荷癌癥患者的免疫系統，如果你體內存在大量腫瘤新抗原，一旦重新激活你的免疫系統，它就有東西可抗擊。
在初始驗證和驗證組（共65名患者），對比治療無響應的患者，對治療有響應的患者都具有較高的突變負荷。此外，高突變負荷組對比中、低突變負荷組，在客觀反應率、無進展生存期和總生存期中均較高。
免疫療法應答表
腫瘤突變負荷免疫療法應答率（%）
低4
中等26
高45
非常高67
2.4 TMB****成為****bio-marker****的優點與局限
TMB可以橫跨多個腫瘤進行橫向分析；可潛在甄別具體的突變模式和推測新抗原負荷；高覆蓋特點可以檢測出罕見的體細胞突變；高通量分析可以為已知驅動突變（比如，EGFR,ALK，ROS1等）；TMB可以量化；可以用于選擇IO治療高獲益人群。
TMB分析技術要求高和時間密集；NGS（如全外顯子組測序）價格昂貴，醫保挑戰；數據復雜需要生物信息學專家解讀；面臨的NGS技術挑戰有，石蠟包埋組織DNA/RNA降解；TMB需要有更多的臨床證據說明與免疫檢查點抑制劑療效之間的關系；TMB作為潛在的bio-marker，cut off需要定義。
總而言之，TMB是潛在的預測IO療效的bio-marker；NGS（next generation sequencing）可以用于檢測TMB（選項有全基因組測序、全外顯子組測序和選擇性基因測序）；高TMB已經被證明與CTLA-4抑制劑治療黑色素瘤和PD-1/PD-L1抑制劑治療黑色素瘤、膀胱癌和NSCLC的臨床療效相關；TMB作為潛在IO biomarker的臨床研究正在進行中，需要探索與PD-L1表達和腫瘤免疫微環境因素之間的關系。
2.5****如何檢測腫瘤突變負荷
TMB（腫瘤突變負荷）是一項新興的診斷方式，可以幫助預測免疫治療在某些腫瘤中的響應，例如肺癌、膀胱癌和黑色素瘤。
美國Foundation和范德寶大學的合作者已經公布了使用TMB的最新數據支持，作為foundation one全面的基因組分析的一部分，是全球唯一可以幫助預測PD-1/L1的治療效果的檢測。這項結果將會添加到以往的證據中，來表明患者可以通過TMB預測免疫治療的獲益程度，這也讓我們更加接近讓最多的患者能從免疫治療中受益的目標，為臨床醫生判定患者是否適合使用PD-1/PD-L1提供依據。
目前，很多臨床研究都顯示，TMB可以預測免疫治療的療效，如Nivomulab，Pembrolizumab和Atezolizumab。但這些臨床試驗中采用不同的檢測平臺進行TMB檢測，且高TMB的cut-off值也各不相同。今后需要前瞻性的在臨床研究以及臨床實踐中，探索和研究最佳的檢測方法和cut-off值。此外，PD-L1表達目前也是比較成熟的免疫預測指標。TMB與PD-L1如何更好的聯合應用，從而篩選最佳的免疫治療獲益人群，也是未來需要探索的重點。
腫瘤的微環境非常復雜，涉及到腫瘤細胞、腫瘤微血管、免疫細胞以及腫瘤間質等，他們之間的關系都需要進行明確的相關性研究，未來需要基于腫瘤微環境免疫特征的生物標記物研究。
