rmats是一款比較好的分析可變剪切的分析軟件，將rmats分析的結果，利用rmats2sashimiplot繪畫出的圖也是比較漂亮的，
可變剪切事件：
可變剪切事件可以分為：
我們就講一下外顯子跳躍事件，
如下圖所示：
上面的那個屬于Exon lnclusion isoform的情況。
下面那個屬于Exon Skipping isoform的情況
外顯子跳躍后，中間的外顯子就沒有了，兩邊的連到一起
那么，測序的reads是如何捕捉到的轉錄本怎么和可變剪切事件的呢？
上圖中左邊為inclusion isofrom, 右邊為skipping isoform, 比對上inclusion isoform的reads 有兩種，分別為紅色和紫色，其中紅色reads只比對到了1號和3號exons上，無法區分這部分reads是來自inclusion isofrom還是skipping reads, 而紫色的reads 比對到了exon2以及exon2與其他exon的連接處，這部分reads可以明確來自inclusion isoform. 所以在統計inclusion isofrom count時，只會計數這部分reads（紫色reads）, 同理，統計skipping isoform的reads數時，只會統計綠色部分的reads。
結果解讀：
那么結果該如何解讀呢？
其中RPKM衡量表達量情況，lnclevel是什么呢？
文獻中給的定義是：
1.lncLevel1 ： inclusion level for SAMPLE_1 replicates (comma separated) calculated from normalized counts（對于sample1）
2.IncLevel2 : inclusion level for SAMPLE_2 replicates (comma separated) calculated from normalized counts（對于sample2）
3.IncLevelDifference ： average(IncLevel1) - average(IncLevel2)
回到剛才，那么
lnclevel是exon inclusion level，是Exon Inclusion Isoform在總（Exon Inclusion Isoform + Exon Skipping Isoform）所占比例
lnclevel的計算公式如下：
ψ = (I/lI)/[(S/lS) + (I/II)]
其中：
- I是指mapping到exon inclusion isoform的reads數
- S指mapping到exon skipping isoform的reads數
- II指exon inclusion isoform的有效長度
- IS 指exon skipping isoform的有效長度
那么有效長度的定義又是什么呢？？？
剛才我們介紹了rMATS只會記錄連接處（紫色和綠色）的reads
以exon skipping為例，每一個連接處都會有8bp左右的anchor，作者默認為8bp，因此有效比對到兩邊exon的長度為 r-2a+1（加 1 是為了防止0值）
因此可以定義出 junction length ：the overall junction region covered by reads across junctions, affected by read length, anchor length (by default 8 bps in both upstream and downstream exons) and exon length
junction length is calcualted as (read length - anchor)*2
假設 read length = 150np；anchor = 8bp，則 junction length = 284bp，skipping的有效長度為135bp
rMATs是根據Likelihood-ratio test來比較兩組樣本可變剪切是否有差異
所以，我們根據這個就可以看兩個樣品是否有可便剪切上的差異了
那么，當Exon inclusion isoform數量較高時，lnclevel1較高；當Exon skipping isoform數量較高時，lnclevel2較高。
如果Exon inclusion isoform數量低的離譜，Exon skipping isoform有一定數量且保持不變那么lnclevel1會接近于0；反之，Exon skipping isoform也一樣。
但是，我們在利用miso或rmats分析可變剪切的時候，往往用sashimiplot進行可視化，其中基于兩款軟件畫圖的reads可能會不一樣，那么：
對于rmats2sashimiplot產生的圖片，我們不需要太過于糾結reads數目和rmats對應不上，只需要看reads分布的大體趨勢即可，重點是關注不同樣本中IncLevel的差異。
這是因為sashimiplot的input是miso的輸出文件，而rmats的output會被sashimiplot轉換成miso的output，才可以繼續作圖
在轉換的過程中由于rmats和miso判斷可變剪切的原理不一樣，所以會造成一定誤差
判斷差異可變剪切的統計學模型
由上面的敘述我們知道判斷某個基因是否存在差異可變剪切是通過 | Ψi1-Ψi2 | ≤ c，其中 i 表示第 i 個基因；Ψ 即為 lnclevel。
首先rmats先計算全部基因的 | Ψi1-Ψi2 | ，并以此擬合出一個分布：
上面這張圖的橫坐標表示 | Ψi1-Ψi2 | ，縱坐標表示頻率（頻數）分布直方圖，也就是表示當 | Ψi1-Ψi2 | 為某值是，對應一共有多少個基因滿足這個條件
那么rmats里面有一個參數是 --cstat，默認為0.01%，也就是說在全部的基因中，存在差異可變剪切的只占0.01%。因此統計全部基因的 | Ψi1-Ψi2 | 值，選擇差異最大的那0.01%，并定義為存在差異可變剪切的基因，那么p_val即為上圖陰影部分的面積
如何理解rMAT結果
前幾列代表的是基因的基本信息：
- chr: 代表染色體
- strand: 代表鏈的信息
而 exonStart_0base ,exonEnd，upstreamES，upstreamEE，downstreamES，downstreamEE代表的是可變剪切的isoform的位置信息：
exonStart_0base ,exonEnd代表skip的外顯子
而：
前面兩列代表顯著性，而lncLevels1和lncLevels2分別對應這不同處理中各個生物學重復的lncLevels值，而lncLevelDifference代表lncLevels1與lncLevels2的差值，若差值很大并且顯著則判斷為差異可變剪切
參考：https://cloud.tencent.com/developer/article/1366294
參考：https://www.biostars.org/p/256949/
參考：http://www.lxweimin.com/p/d2f00c1c9067
