DNA甲基化是表觀遺傳學研究中的一個重要一個分支，符合表觀遺傳學DNA的序列信息沒有改變的特地點，而是DNA的堿基發生了化學修飾。最常見的一種修飾如5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine, 5mC）。相關研究有關注于甲基化與基因表達調控、基因印記、X染色體失活、胚胎發育、腫瘤發生等。

甲基化的研究技術

總體上來說可以分為兩類：一種是測序，一種是芯片。

• 測序
  如全基因組DNA甲基化測序（Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS）和簡化甲基化測序 (Reduced representation bisulfite sequencing, RRBS)，前者是利用 Bisulfite（重亞硫酸鹽）將未甲基化的C堿基轉換為U，而甲基化的C堿基不變的原理，從而對甲基化信號檢測。后者是根據酶切 (Msp I) 富集啟動子及CpG島區域，并進行Bisulfite測序，同時實現DNA甲基化狀態檢測的高分辨率和測序數據的高利用率。
  
  BS-seq原理
  
  
• 甲基化芯片
  Illumina的Infinium BeadChip芯片，包括HumanMethyation450（450K）和MethylationEPIC（850K）

甲基化分析流程

上游分析的主要目的提取甲基化位點，得到差異甲基化位點和甲基化區域（DML/DMR, DNA methylation loci/region）,下游分析比較靈活，甲基化分析通常與其他組學聯合分析，如：

• 聯合轉錄組，對DML/DMR區域內的基因進行功能富集分析（可用的軟件有TopGO ，GSEABase ， Enrichr），以及與非編碼RNA的整合分析等
• 聯合組蛋白修飾，一是借助組蛋白修飾可以注釋DML/DMR基因組分布，是否在啟動子或增強子等區域
• 聯合基因組，分析與甲基化與突變、變異的關系

STEP1:比對，提取甲基化位點

對于BS-seq甲基化位點的提取，常用的軟件有Bismark，bismark可以將bisulfite處理的reads比對到參考基因組上，同時提取甲基化位點。輸出結果可以直接導入到基因組瀏覽器（如IGV, SeqMonk）中查看甲基化水平。主要特點可以概括為以下幾個方面：

• 一步實現Bisulfite 比對和提取甲基化位點和區域
• 支持單端和雙端測序
• 支持ungapped, gapped or spliced alignments
• 輸出區分胞嘧啶甲基化在CpG, CHG和CHH
  流程代碼參考：https://github.com/FelixKrueger/Bismark/tree/master/Docs

使用方法
主要分為3步：

• 1 . 準備參考基因組，需要將參考基因組進行bisulfite 轉換和建索引, 建索引是基于bowtie2和hisat2 bowtie2-build or hisat2-build
USAGE: bismark_genome_preparation [options] <path_to_genome_folder>

bismark_genome_preparation --path_to_aligner /usr/bin/bowtie2/ --verbose /data/genomes/homo_sapiens/GRCh38/

• 2 . 比對
  比對前需要先進行質控，默認比對模式是bowtie2，輸出文件格式默認是bam文件，標準的比對方式設置multi-seed 的長度為20bp，即-L 20，0 錯配：-N 0。
  USAGE:bismark [options] --genome <genome_folder> {-1 <mates1> -2 <mates2> | <singles>}
  單端測序：

bismark --bowtie2 -N 0 -L 20  -o mapping-out ref data.fastq
# ref:是參考基因組的文件夾
# -o: mapping-out輸出文件夾
# --bowtie2：默認模式，可選參數

• 3 .提取甲基化位點
  甲基化輸出文件中的符號的含義：點.和小寫的z，x,h,u都表示無甲基化，代表的類型分別是CpG，CHG，CHH，CN or CHN，大寫的z，x,h,u都表示有甲基化。

在提取甲基化位點前需要先去重, 不過對RRBS, amplicon以及靶向測序不建議去重。
USAGE: ./deduplicate_bismark [options] filename(s)

deduplicate_bismark -s mapping-out/test_data_bismark_bt2.bam

call DML/DMR

mkdir CpGout
bismark_methylation_extractor -s --gzip --bedGraph --buffer_size 1G \
--cytosine_report --genome_folder ref/ test_data_bismark_bt2.deduplicated.bam

輸出結果：

• 第一列測序信息
• 第二列甲基化狀態，+代表甲基化，- 代表未甲基化
• 第三列代表chromosome
• 第四列代表location
• 第五列代表methylation call

STEP2：差異甲基化區域分析

差異甲基化位點和區域（DML/DMR）的區別

edmr

edmr是基于雙峰正態分布模型和區域甲基化分析的成本函數優化DMR分析https://github.com/ShengLi/edmr](https://github.com/ShengLi/edmr。

# Step 1. Load add-on packages and example data

library(edmr)
library(GenomicRanges)
library(IRanges)
library(mixtools)
library(data.table)
data(edmr)
# Step 2. myDiff evalution and plotting

# fitting the bimodal normal distribution to CpGs distribution
myMixmdl=myDiff.to.mixmdl(myDiff, plot=T, main="example")

# plot cost function and the determined distance cutoff
plotCost(myMixmdl, main="cost function")

# Step 3. Calculate DMRs

# calculate all DMRs candidate
mydmr=edmr(myDiff, mode=1, ACF=TRUE)

# further filtering the DMRs
mysigdmr=filter.dmr(mydmr)

## annotation
# get genebody annotation GRangesList object
#genebody=genebody.anno(file="http://edmr.googlecode.com/files/hg19_refseq_all_types.bed")
genebody.file=system.file("extdata", "chr22.hg19_refseq_all_types.bed.gz", package = "edmr")
genebody=genebody.anno(file=genebody.file)

# plot the eDMR genebody annotation
plotdmrdistr(mysigdmr, genebody)

# get CpG islands and shores annotation
#cpgi=cpgi.anno(file="http://edmr.googlecode.com/files/hg19_cpgisland_all.bed")
cpgi.file=system.file("extdata", "chr22.hg19_cpgisland_all.bed.gz", package = "edmr")
cpgi=cpgi.anno(file=cpgi.file)

# plot the eDMR CpG islands and shores annotation
plotdmrdistr(mysigdmr, cpgi)

# prepare genes for pathway analysis with significant DMRs at its promoter regions 
dmr.genes=get.dmr.genes(myDMR=mysigdmr, subject=genebody$promoter, id.type="gene.symbol")
dmr.genes

DSS

DSS是基于貝塔二項分布，可以用于分析DML/DMRs)， 包括三個模塊： -兩組比較（有重復） ，兩組比較（無重復） ，多組比較，參考https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DSS.html。
DSS的輸入格式如下：

• 第一列是染色體號
• 第二列是位置
• 第三列總的read counts

• 第四列是甲基化的read counts
  第三列的數字要大于或等于第四列，要保證第三列和第四列數據類型是數字格式

  
  

library(DSS)
# 創建BSseq對象
if(T){
 sn[c(1,11,2,12)]
 BSobj <- makeBSseqData(allDat[c(1,11,2,12)],sn[c(1,11,2,12)])[1:5000,]
 BSobj 
 save(BSobj,file = 'group-BSobj.Rdata')
 dmlTest <- DMLtest(BSobj,   group1=c("A0R_d0_rep1","A0R_d0_rep2"),
 group2=c("A3R_d0_rep1","A3R_d0_rep2"),smoothing=F)
 head(dmlTest) 
}
##  call DML/DMR
# using callDML function to call DML
# call DML
dmls = callDML(dmlTest, p.threshold=0.001)
head(dmls)
# call DMR
dmrs = callDMR(dmlTest, p.threshold=0.01)
head(dmrs)
# visulization
showOneDMR(dmrs[1,], BSobj)

甲基化芯片的分析可以參考：http://www.lxweimin.com/p/6411e8acfab3

相關參考文章

使用DSS包多種方式檢驗差異甲基化信號區域