好了，這一篇我們繼續分享單細胞空間聯合分析的文章，大業未完成，我們仍需要努力，參考文章在Spatiotemporal transcriptomics reveals pathogenesis of viral myocarditis,雖然是圣誕節，奈何單身狗，還是好好學習吧。
ABSTRACT
兒童和年輕人猝死的很大一部分是由于病毒性心肌炎，一種心臟炎癥性疾病。在這里，使用集成的單細胞和空間轉錄組學來研究與呼腸孤病毒誘導的新生小鼠心臟心肌炎相關的宿主病毒相互作用的時間、空間和細胞異質性。進一步分析了呼腸孤病毒感染的主要部位腸道，以確定病毒的細胞靶點和最終導致心肌炎的分子事件的時間順序。數據深入了解先天免疫反應的細胞類型特異性，以及招募循環免疫細胞的發炎心臟細胞的轉錄狀態，包括誘導細胞焦亡的細胞毒性 T 細胞。心肌區域和邊界區空間受限基因表達的分析確定了免疫介導的細胞類型特異性損傷和應激反應。總體而言，觀察到與病毒性心肌炎相關的復雜的細胞表型和細胞相互作用網絡。
INTRODUCTION
病毒感染是心肌炎的最常見原因。由此產生的炎性心肌病可導致心律失常、擴張型心肌病和死亡。在人類中，病毒性心肌炎的研究具有挑戰性，因為可用診斷測試的敏感性低、疾病的急性發作、疾病的局灶性以及復雜心臟組織中免疫-病毒相互作用的極端異質性。在小鼠中，哺乳動物正腸病毒提供了靈活的模型系統。口服接種后，1 型朗 (T1L) 呼腸孤病毒株最初感染胃腸道。幾天之內，感染會擴散到身體的繼發部位，包括心臟，導致多達 50% 的感染發生心肌炎。然而，即使在這種小鼠模型中，病毒性心肌炎的分子發病機制也很難研究，因為所涉及的心臟和免疫細胞類型的復雜網絡以及疾病的細胞、空間和時間異質性。因此，既沒有確定負責先天免疫反應的細胞類型，也沒有確定體內感染的細胞類型。同樣，心臟內受感染和未受感染的旁觀者細胞的反應尚未得到表征。此外，適應性免疫反應的保護性與破壞性影響尚未量化。在患有嚴重聯合免疫缺陷 (SCID) 的小鼠身上進行的實驗表明，心肌損傷和心力衰竭不需要適應性免疫反應，但這些觀察結果并不排除免疫細胞介導的損傷在免疫活性小鼠中很重要的可能性。需要根據受感染心臟組織內的時間和位置對所有細胞表型進行無偏見的表征，以解決這些知識空白。
在這里，使用集成的單細胞和空間分辨 RNA 測序 (RNA-seq) 來研究感染后多個時間點呼腸孤病毒感染的新生小鼠心臟心肌過程的細胞和空間異質性。還應用這些技術來研究腸道內呼腸孤病毒感染的先天反應。此外，對感染不引起心肌炎的呼腸孤病毒點突變體的小鼠心臟組織進行了時間序列單細胞 RNA-seq (scRNA-seq)。為了建立病毒嗜性，對非聚腺苷酸化病毒轉錄本進行了分子富集。測量可以深入了解先天免疫反應的細胞類型特異性、腸道和心臟中病毒的趨向性以及參與炎癥細胞因子產生和循環免疫細胞募集的細胞類型的轉錄狀態.對心肌區域和這些區域周圍邊界區的空間受限基因表達的分析確定了不同細胞類型（包括心肌細胞）的損傷和應激反應。總體而言，數據確定了呼腸孤病毒誘導的心肌炎期間空間受限的細胞相互作用和細胞類型特異性宿主反應。
RESULTS
Single-cell and spatial transcriptomics of reovirus T1L-infected neonatal mice hearts
為了闡明呼腸孤病毒誘導的心肌炎的發病機制，分析了從被呼腸孤病毒 T1L 株或模擬對照口服感染的新生小鼠收集的心臟組織。在感染后 (dpi) 4、7 和 10 天生成了來自受感染心臟和模擬對照的 31,684 個細胞的 scRNA-seq 數據，以及來自受感染心臟的四個組織切片的 8,243 個空間轉錄組和來自同一窩的 4 dpi 和 7 dpi 模擬對照。單細胞轉錄組代表 18 種不同的細胞類型，包括心肌細胞、心內膜細胞、心臟成纖維細胞、內皮細胞、壁細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、NK 細胞、樹突細胞、T 細胞和 B 細胞。空間轉錄組數據的聚類揭示了 7 dpi 呼腸孤病毒感染心臟中心肌區域和心肌區域周圍的邊界區域的不同轉錄程序，這些區域對應于通過 H&E 染色確定的組織損傷區域。 scRNA-seq 和空間轉錄組學的結合能夠在空間環境中解析和可視化細胞類型和基因表達。由于病毒在傳播到包括心臟在內的其他身體部位之前首先感染胃腸道，因此還在回腸上進行了 scRNA-seq 和空間轉錄組學。在 1 dpi 和 4 dpi 從模擬和感染樣本中獲得了回腸的 7,695 個單細胞轉錄組和 8,027 個空間點轉錄組。
- 注：Supplementary Figure 1: Single-cell and spatial transcriptomics of cardiac tissue from reovirus-infected neonatal mice. A) Number of unique genes detected per cell (left), number of unique transcripts per cell (center), and percentage of mitochondrial transcripts (right) in cardiac scRNA-seq datasets from three stages after infection. B) Number of unique genes detected per cell (left), number of unique transcripts per cell (center), and percentage of mitochondrial transcripts (right) in cardiac spatial transcriptomics datasets from two stages after infection. C) UMAP plot of 31,684 single-cell transcriptomes from mock-infected and reovirus-infected hearts at 4, 7, and 10 days post-infection (dpi), clustered by gene expression and colored by cardiac cell type. Dotted lines show the cardiac cell types being grouped as broad endothelial cells and fibroblast cells. D) scRNA-seq UMAP plots showing expression of endothelial, and mural cell-specific markers used to define the Cdh5+ Kcnj8+ mesenchymal endothelial cells. E) Top 3 differentially expressed genes for cell types in heart scRNA-seq data. F) Spatial cell type proportions for myocarditic heart at 7 dpi derived by integrating scRNA-seq and spatial transcriptomics data using the Stereoscope method from scvi-tools.
為了準確地識別回腸和心臟中未聚腺苷酸化的呼腸孤病毒轉錄本，對 scRNA-seq 文庫中捕獲的病毒片段進行了基于雜交的富集。在回腸中，總共捕獲了 13,100 個獨特的病毒轉錄本，病毒載量從 1 dpi 降低到 4 dpi。在 1 dpi 時，腸內分泌細胞的感染細胞比例最高，其次是腸上皮細胞和杯狀細胞，所有這些細胞都存在于腸道上皮中。淋巴內皮細胞在 4 dpi 時被感染，這表明病毒通過淋巴引流到達血液，從而使病毒能夠傳播到身體的二級部位，包括心臟。從 T1L 感染的心臟中的 392 個細胞中捕獲了 2,762 個獨特的病毒轉錄本。病毒載量首先從 4 dpi 增加到 7 dpi，然后從 7 dpi 減少到 10 dpi，與對整個心臟進行的病毒滴度測定一致。心內膜細胞和內皮細胞是 4 dpi 時最常感染的細胞類型，這表明心室腔內壁的心內膜細胞和心臟脈管系統內的內皮細胞是心臟中最先被感染的細胞之一。在 7 dpi 心臟中檢測到中性粒細胞、樹突細胞和 T 細胞中的病毒轉錄物。這一觀察結果表明，抗原呈遞細胞和免疫細胞可能有助于感染擴散到身體的其他器官。之前已經討論了受感染的樹突狀細胞在全身感染期間將更多呼腸孤病毒帶到心臟組織中的作用。
- 注：Supplementary Figure 2: Single-cell and spatial transcriptomics of ileum tissue from reovirus-infected neonatal mice. A) Number of unique genes detected per cell (left), number of unique transcripts per cell (center), and percentage of mitochondrial transcripts (right) in ileum scRNA-seq datasets (top row) and ileum spatial transcriptomics datasets (bottom row) from two stages after infection. B) Top 3 differentially expressed genes for cell types in ileum scRNA-seq data. C) Spatial transcriptomes of ileum tissue sections from mock-infected and reovirus-infected mice at 1 and 4 dpi. D) Knee plot showing host gene specific UMI counts (left) and viral UMI counts in the scRNA-seq droplets classified as either empty droplets or with viable/dead cells across ileum scRNA-seq samples. E) scRNA-seq UMAP plots showing total viral UMI counts per cell before and after xGen-based viral transcript enrichment on ileum samples. F) Knee plot showing host UMI counts (left) and viral UMI counts in the scRNA-seq droplets classified as either empty droplets or with viable/dead cells across heart scRNA-seq samples. G) scRNA-seq UMAP plots showing total viral UMI counts per cell before and after xGen-based viral transcript enrichment on heart samples.
Endothelial cells are primed with basal interferon response and play an important role in initiating host innate immune response
為了檢測感染后心臟組織中的早期轉錄差異，進行了差異基因表達分析（DGEA，4 dpi 模擬與感染心臟，方法該分析揭示了感染心臟中 226 個基因的顯著上調（雙側威爾科克森檢驗， log fold-change > 1.0 and p-value < 0.01)，包括與干擾素-β途徑、干擾素信號傳導和先天免疫反應相關的基因。
為了量化和比較不同細胞類型的早期感染反應的總體幅度，計算了一個基因模塊評分（感染反應評分，IR，上面選擇的 226 個基因的模塊）。不同細胞類型在沒有感染的情況下的 IR 比較顯示，與其他心臟細胞類型相比，內皮細胞中的 IR 較小，但較高。作為對感染的反應，觀察到所有心臟細胞類型的 IR 增加，但觀察到內皮細胞的 IR 增加最大。這些數據表明，心臟脈管系統內襯的內皮細胞是宿主抵御病毒感染的重要發起者。使用空間轉錄組學數據比較 IR 分數顯示，感染心臟在 4 dpi 和 7 dpi 中的 IR 分數增加，心肌區域的分數最高。鑒于觀察到心臟內的內皮細胞在沒有感染的情況下具有最高的 IR 評分，我們query這種觀察是心臟組織獨有的還是更普遍的現象。為此，使用了 Tabula Muris scRNA-seq 小鼠圖譜并估計了 10 個不同器官的約 16,000 個細胞的 IR，包括五種主要細胞類型（上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞、平滑肌細胞和間充質細胞）和組織。該分析表明，內皮細胞在小鼠的所有組織中始終具有最高的 IR 評分。這些結果表明，血管內皮細胞在大多數組織內具有更高的先天反應基因的基礎表達，這可能使這些細胞對血液和淋巴管內的病毒傳播做出反應。
為了研究呼腸孤病毒感染的主要部位回腸中的細胞類型特異性 IR，與模擬感染的回腸細胞相比，在 1 dpi 時對呼腸孤病毒感染進行了 DGEA，發現 438 個基因顯著上調（雙側 Wilcoxon測試，對數倍數變化 > 1.0 和 p 值 < 0.01)，與干擾素-β 通路、干擾素信號傳導和先天免疫反應有關。使用這個由 438 個基因組成的模塊計算了 IR 評分，并觀察到與其他回腸細胞類型相比，腸細胞和腸內分泌細胞的基礎 IR 評分更高。腸上皮細胞在感染后進一步表現出最高的 IR 評分增加，其次是腸內分泌細胞、內皮細胞和淋巴細胞。空間轉錄組數據的 IR 分數的比較進一步支持了對 scRNA-seq 數據的分析，顯示感染回腸在 1 dpi 和 4 dpi 中的 IR 分數增加，其中腸黏膜和絨毛中的分數最高。腸上皮細胞必須耐受腸腔中存在的共生微生物，但仍對侵入性病原體有反應。數據分析表明，為了實現這一目標，腸道上皮細胞中的腸上皮細胞和腸內分泌細胞以基礎干擾素反應為基礎，并在病毒感染早期階段的先天免疫反應中發揮重要作用。
- 注：Supplementary Figure 3: Innate immune response across cell types in heart and ileum and transcriptional signatures for Cxcl9-high endothelial cells and cytotoxic T cells. A) Volcano plot showing differentially expressed genes (two-sided Wilcoxon Rank-Sum test, -log2 fold change > 2.0 and p-value < 10-4) for reovirus-infected cardiac cells as compared to mock at 4 dpi. Dotted lines show the thresholds for significantly enriched genes (red). B) Top GO terms for genes enriched in reovirus-infected cardiac cells as compared to mock at 4 dpi. C) Heatmap showing the expression of the 25 most upregulated genes in the reovirus-infected ileum as compared to mock at 1 dpi. D) Top GO terms for genes enriched in reovirus infected cells ileum as compared to mock-infected ileum at 1 dpi. E) Volcano plot showing differentially expressed genes (two-sided Wilcoxon Rank-Sum test, -log2 fold change > 2.0 and p-value < 10-4) upregulated in Cxcl9-high inflamed endothelial cells from heart at 7 dpi. Dotted lines show the thresholds for significantly enriched genes (red). F) Top GO terms of interest enriched for genes upregulated in Cxcl9-high endothelial cells in myocarditic heart at 7 dpi. G) Volcano plot showing differentially expressed genes (two-sided Wilcoxon Rank-Sum test, -log2 fold change > 2.0 and p-value < 10-4) upregulated in cytotoxic T cells at 7 and 10 dpi. Dotted lines show thresholds for significantly enriched genes (red). H) Top GO terms of interest enriched for genes upregulated in cytotoxic T cells in myocarditic hearts at 7 and 10 dpi. I-L) Spatial transcriptomics maps of cardiac tissue sections from reovirus-infected mice pups at 7 dpi showing I) The expression of genes enriched in Cxcl9-high inflamed endothelial cells. J) Gene module scores for four GO terms of interest enriched in Cxcl9-high inflamed endothelial cells. K) The expression of genes enriched in cytotoxic T cells from myocarditic heart. L) Gene module scores calculated for four GO terms of interest enriched in cytotoxic T cells from myocarditic heart.
Cytotoxic T cells recruited by inflamed endothelial cells induce pyroptosis
為了更詳細地探索內皮細胞表型的異質性，在 scRNA-seq 數據中重新聚集了 9,786 個心臟內皮細胞。觀察到四種不同的表型 i) 表達 Nr2f2 和 Aplnr 的未發炎的靜脈內皮細胞主要來源于模擬對照，ii) 表達 Gja4、Gja5 和 Cxcl12 的動脈內皮細胞來源于模擬和感染的心臟，iii) 發炎的內皮細胞來源于感染4 dpi 和 10 dpi 時的心臟，以及 iv) 7 dpi 時來自心臟的發炎內皮細胞，b 發炎的內皮細胞簇表達 Isg15、Iigp1 和 Ly6a。 DGEA acro 內皮亞群顯示，發炎的 7 dpi 內皮細胞過度表達趨化因子 Cxcl9 和 Cxcl10，它們通常參與免疫調節和炎癥過程，但更具體地參與 T 細胞的募集。與這一觀察結果一致，7 dpi 心臟中的 T 細胞表達 Cxcr3 受體。 Cxcl9 高發炎的內皮細胞還表達高水平的細胞粘附標記基因 Vcam1 和 Icam1，這有助于血液中的免疫細胞附著在內皮細胞上。內皮細胞還過表達 MHC 1 類（H2-D1 和 H2-K1）和 MHC 2 類（Cd74）分子，表明它們參與抗原呈遞給適應性免疫細胞。內皮細胞已被證明參與抗原呈遞和塑造感染性心肌炎中的細胞免疫反應。GO富集分析確定了進一步支持 Cxcl9 高內皮細胞參與白細胞細胞粘附、T 細胞活化、白細胞介素 8 產生的調節以及對細胞因子、腫瘤壞死因子、干擾素-γ、白細胞介素-1 的反應的途徑。
觀察到內皮細胞參與 T 細胞的募集，促使更詳細地探索受感染心臟中 T 細胞的異質性。為此，重新聚集了 2,205 個 T 細胞單細胞轉錄組，產生了代表三種 T 細胞亞型的四個subclusters，i) Cd8+ 細胞毒性 T 細胞，ii) Cd4+ 輔助 T 細胞，和 iii) 幼稚 T 細胞。在受感染心臟內鑒定的細胞毒性和輔助 T 細胞均表達 Cxcr3 受體、干擾素-γ (Ifng) 和趨化因子 Ccl3、Ccl4、Ccl5、S100A4 和 S100A6，表明它們參與了中性粒細胞的募集和激活。 Cxcr3 受體選擇性結合趨化因子 Cxcl9 和 Cxcl10，促進趨化性。細胞毒性 T 細胞代表大多數浸潤性 T 細胞，并表達 Prf1、Gzma、Gzmb 和 Gzmk，編碼與顆粒酶依賴性胞吐作用途徑相關的裂解分子。這些細胞還表達腫瘤壞死因子超家族基因 Fasl 和 Tradd，它們參與 Fas 誘導的細胞死亡途徑。 Fasl 與靶細胞表面的 Fas 結合并介導程序性細胞死亡信號傳導和 NF-κB 激活。 Fasl-Fas 凋亡通路在調節 T 細胞、促進對自身抗原的耐受性方面很重要，并且是細胞毒性 T 細胞殺死靶細胞的一種機制。 GO 富集分析確定了涉及中性粒細胞活化和脫粒、外源肽抗原的加工和呈遞、白細胞介素 1 介導的信號通路、腫瘤壞死因子介導的信號通路、NIK/NF-κB 信號通路、對凝集素的細胞反應和細胞凋亡過程的通路。
細胞死亡相關通路的下游基因標記 Pycard、Acer2、Zbp1 和 Caspases Casp1、Casp4 和 Casp12 在 Cxcl9 高內皮細胞中富集。這增加了細胞毒性淋巴細胞導致炎癥內皮細胞死亡的可能性。內皮細胞的 GO 富集證實了細胞死亡途徑的上調，包括參與凋亡過程的半胱氨酸型內肽酶活性的激活、外源性凋亡信號通路的正調節和細胞焦亡途徑。我們評估了空間轉錄組數據以驗證 Cxcl9 高炎癥內皮細胞和 T 細胞之間的直接相互作用，并且它們確實在心肌區域和邊界 zo 中在空間上共定位。計算了與本體相關基因的基因模塊評分，這些基因富含 Cxcl9 高內皮細胞和細胞毒性 T 細胞，用于空間轉錄組學數據，發現這些途徑在心肌區域富集。總的來說，這些結果表明心臟血管內皮細胞充當血心屏障，并在宿主適應性免疫系統的募集和激活中發揮重要作用。這些細胞可能是呼腸孤病毒誘導的心肌炎期間直接病毒損傷和免疫介導損傷的目標。心臟內微脈管系統的損傷可能會導致血液供應減少，并成為隨后與病毒直接復制無關的心肌細胞死亡的一個因素。
Spatially restricted gene expression in myocarditic tissue
心肌炎的空間受限性質促使探索呼腸孤病毒感染心臟中基因表達的空間異質性。對空間轉錄組數據的初始聚類揭示了心肌區域、與這些心肌區域相鄰的組織以及心室組織的其余部分的不同轉錄程序。這些區域的差異空間基因表達分析揭示了浸潤免疫細胞的細胞類型標志物（T細胞的 Cd8a 和 Gzma，NK 細胞的 Nkg7，中性粒細胞的 S100a8）、炎癥標志物（Cd52 和 Lyc62）的心肌區域的上調，以及趨化因子和細胞因子（Ccl5、Ccl2、Cxcl9 和 Cxcl10）。對相應 scRNA-seq 數據的分析表明，Ccl5 由樹突細胞表達，Ccl2 由成纖維細胞表達，Cxcl9 和 Cxcl10 由內皮細胞表達。 Ccl2 的受體 Ccr2 在巨噬細胞中表達，表明成纖維細胞在心肌炎癥期間使用 Ccl2-Ccr2 軸進行巨噬細胞募集，如最近所述。這些分析表明產生趨化因子的內皮細胞和產生細胞因子的成纖維細胞將免疫細胞募集到心肌組織。
對心肌區域和邊界區的仔細檢查顯示其他感興趣的基因上調，包括 Timp1、AW112010、Clu、Ankrd1、Gm4841 和 Ctss。 Timp1 在 scRNA-seq 數據中主要由發炎的成纖維細胞表達。 Timp1 是基質金屬蛋白酶 (MMP) 的天然抑制劑，這是一組參與細胞外基質降解的肽酶。先前報道了在心力衰竭惡化的患者中 Timp1 的上調。 AW112010 在 scRNA-seq 數據中由發炎的內皮細胞和成纖維細胞表達，之前被發現編碼干擾素誘導的小分泌蛋白，在對感染和炎癥的先天免疫反應中起關鍵作用。在數據中，Clu 在來自所有心臟細胞類型的發炎細胞的一個子集中表達，并且先前顯示在嚴重心肌炎期間上調。 Ctss 主要在單核細胞中表達，編碼一種蛋白酶，用于將抗原蛋白降解為肽，以在 MHC II 類分子上呈遞。已證明易感小鼠中免疫蛋白酶體的形成增加會影響病毒性心肌炎中抗原肽的產生和隨后的 T 細胞活性。對邊界區上調基因的 GO 分析揭示了與對腫瘤壞死因子的反應、對白細胞介素-1 的反應和 NIK/NF-κB 信號傳導相關通路的富集。
為了進一步了解免疫細胞浸潤對心肌區域周圍細胞類型組成的影響，評估了細胞類型比例作為與組織中心肌區域距離的函數。 我們量化了心肌區域、邊界區和心室組織其余部分的細胞類型比例，發現 Cxcl9 高內皮細胞、Ccl2+ 成纖維細胞、T 細胞、樹突細胞和 NK 細胞的比例在 心肌區，心肌區心肌細胞比例減少。
為了了解在心肌區和邊界區富集的 Ccl2+ 成纖維細胞的表型，從 scRNA-seq 數據集中重新聚集了 9,192 個成纖維細胞，并在 7 dpi 時從受感染的心臟中鑒定了一組不同的發炎 Ccl2+ 成纖維細胞。 這
287 個 Ccl2+ 成纖維細胞表達高水平的 MHC 1 類（H2-D1 和 H2-K1）、粘附標記基因 Vcam1 和 Icam1，以及其他基因，如 Serpina3g、C3 和 Ms4a4d。 此外，這些成纖維細胞還表達 Casp1 和 Casp4，表明響應細胞毒性 T 細胞的細胞pyroptosis activity。
為了研究炎癥對心肌細胞中心肌細胞的影響，從 scRNA-seq 數據集中重新聚集了 502 個心肌細胞，并確定了三種不同的表型：i) 表達 Myl2、Myl3 和 Mb 的心室肌細胞來自模擬和感染的心臟在 4 和 10 dpi，ii) 表達標記物 Myl4、Myl7 和 Nppa 的心房肌細胞在 4 dpi 和 10 dpi 時源自模擬和受感染的心臟，以及 iii) 在 7 dpi 時來自感染心臟的發炎肌細胞表達先天免疫基因 Isg15、Igtp 和 Iigp1。與來自感染心臟的 4 dpi 和 10 dpi 的心肌細胞相比，7 dpi 感染心臟的發炎肌細胞具有不同的表型，后者與來自模擬 299 感染心臟的心肌細胞聚集在一起。為了找到存在于邊界區的肌細胞的轉錄特征，我們選擇了在 scRNA-seq 數據中富含心肌細胞并在邊界區上調的基因。該分析顯示邊界區的心肌細胞表達 Gm4841、Gm12185、Mt1、Mt2、Ankrd1 和 Nppb。 Gm4841 和 Gm12185 是響應干擾素 304 γ 產生的干擾素誘導基因。 Mt1 和 Mt2 基因調節炎癥并支持小鼠缺血性心肌病的重塑。 Ankrd1 是一種肌細胞存活因子，發生在特發性擴張型心肌病患者的晚期心臟病期間。最近的一項研究表明，在心肌梗塞后第 1 天，表達 Ankrd1 的心肌細胞位于邊界區。總之，我們的分析表明，組織損傷定位于心肌區域，在邊界區進行重塑程序活躍，并證明了空間分辨分子測量對研究病毒性心肌炎的重要性。
- 注：Supplementary Figure 4: Cell-type-specific gene expression in myocarditic tissue and differences in viral tropism between reovirus wildtype (WT) and mutant (K287T) infection. A) Volcano plot showing differentially expressed genes (two-sided Wilcoxon Rank-Sum test, -log2 fold change > 0.5 and p-value < 10-2) upregulated in myocarditic regions in heart at 7 dpi as defined by unsupervised clustering on spatial transcriptomes. Dotted lines show the thresholds for significantly enriched genes (red). B) UMAP plot for heart scRNA-seq cells and spatial transcriptomic maps for reovirus-infected heart at 7 dpi showing the expression of Ccl2 ligand and Ccr2 receptor. C) Volcano plot showing differentially expressed genes (two-sided Wilcoxon Rank-Sum test, -log2 fold change > 0.5 and p-value < 10-2) upregulated in the border zone of the infected heart at 7 dpi, as defined by unsupervised clustering on spatial transcriptomes. Dotted lines represent thresholds for significantly enriched genes (red). D) scRNA-seq UMAP plots showing the expression of six genes of interest enriched in myocarditic regions and the border zone. E) Top GO terms of interest for genes upregulated in Cxcl9-high endothelial cells in myocarditic heart at 7 dpi. F) Spatial transcriptomic maps for myocarditic heart at 7 dpi showing the expression of six myocyte-specific genes upregulated in the border zone. G) UMAP plot of 9,192 fibroblast cell transcriptomes from mock-infected and reovirus-infected hearts at 4, 7, and 10 dpi colored by fibroblast cell subtypes (phenotypes) (top) and condition (bottom). H) Heatmap showing top-five differentially expressed genes (Wilcoxon test, log2 fold-change > 1.0 and p-value < 0.01) for fibroblast cell subtypes. I) UMAP plot showing the expression of genes upregulated in Ccl2+ fibroblast cells. J) UMAP plots showing the gaussian kernel density of scRNA-seq cells across mock-infected, reovirus-WT infected, and reovirus-K287T infected hearts. K) Bar plot showing mean viral transcript count (UMIs) across stages for mock-infected, reovirus-WT infected, and reovirus-K287T infected hearts. L) Dot plot showing the percentage of cells with non-zero viral transcripts and the mean viral transcript counts (UMIs) across cell types.
Reduced adaptive immune cell infiltration associated with reovirus K287T mutant
最近報道了一種呼腸孤病毒突變體 T1L S4-K287T (K287T)，它對編碼外衣殼蛋白 sigma-3 (σ3) 的 S4 基因進行了點突變，這是一種雙鏈 (ds) RNA 結合多功能蛋白，可促進病毒蛋白合成和促進病毒進入
部件。 K287T 成功感染心臟，但產生的病毒滴度相對于呼腸孤病毒野生型 (WT) 而言較低，并且不會引起心肌炎。為了驗證發現，在 4、7 和 10 dpi 時對 K287T 感染的心臟進行了額外的 scRNA-seq。總共生成了 16,771 個單細胞轉錄組，并將這些數據與來自 w 型 (WT) 病毒的數據進行了整合。對于幾乎所有細胞類型，K287T 感染的細胞與 WT 感染的細胞聚集在一起。進行了病毒轉錄本富集，并比較了 WT 和突變體感染細胞中的病毒轉錄本。在 4 dpi 時發現病毒轉錄本 WT 和 K287T 病毒的水平相似，但在 7 dpi 時 K287T 的病毒載量降低了 60 倍，與病毒滴度測定一致。然后比較了由于 K287T 和 WT 感染引起的卡片細胞類型之間的早期宿主反應。 K287T 誘導了與 WT 呼腸孤病毒相似水平的先天免疫反應，內皮細胞在 4 dpi 時心臟評分的增幅最高。分析了 K287T 和 WT 感染的心臟之間 Cxc 高內皮細胞和免疫細胞的細胞類型組成，發現 7 dpi K287T 感染的心臟在 7 dpi 中浸潤心臟的 Cxcl9 高內皮細胞和免疫細胞顯著減少WT 感染的心臟。這些差異與與 K287T 突變體相關的炎癥和組織損傷水平降低一致。結果表明，即使感染了 K287T 突變病毒，大多數類型的復制減少，心臟內皮細胞也會產生強大而強大的先天免疫反應。病毒從感染細胞中清除 7 dpi 和較弱的適應性宿主反應然后導致突變 K287T 感染心臟的非心肌表型。
DISCUSSION
50 多年來，病毒性心肌炎一直被認為是導致心力衰竭的原因，但它仍然是一種研究、診斷和治療的具有挑戰性的疾病。在這里，使用集成的 spa 和單細胞 RNA-seq 來剖析新生小鼠模型中 reovir 誘導的急性心肌炎的時間、空間和細胞異質性。在感染后的多個時間點檢測了回腸和心臟組織。我們研究了被感染的細胞類型，以及先天性和適應性免疫反應的細胞和空間異質性。生成總共十三個 scRNA-seq 和八個空間轉錄組數據集，跨越兩個有機體四個時間點和三個感染條件。我們的數據提供了對導致呼腸孤病毒誘導的心肌炎的分子事件的年表的詳細見解。口服接種后，呼腸孤病毒 T1L 在 1 dpi 內感染腸道上皮中的腸內分泌和腸上皮細胞。這些細胞會產生有效的先天免疫反應來抑制病毒復制。然后病毒會在 4 dpi 內感染腸道淋巴細胞，并通過淋巴引流，病毒通過血流傳播到身體的次要部位，包括心臟。大約 4 dpi，病毒會感染心臟血管系統的內皮細胞。內皮細胞在心臟中產生強大的先天免疫反應。在有癥狀的情況下，發炎的內皮細胞會分泌趨化因子來招募循環免疫細胞，包括細胞毒性 T 細胞。組織浸潤的細胞毒性 T 細胞然后在心肌組織中誘導細胞焦亡。總體而言，實驗揭示了與呼腸孤病毒誘導的心肌炎相關的細胞表型和細胞間相互作用的動態和空間異質網絡。
集成的高通量 scRNA-seq 和空間轉錄組學最近被用于研究心臟發育和心臟病，但在工作之前，這些方法尚未用于研究病毒性心肌炎。 Bulk RNA-seq 先前已被用于分析與病毒性心肌炎相關的感染、炎癥和組織損傷的轉錄組學特征。然而，這些整體水平的方法并沒有捕捉到宿主對感染反應的細胞和空間異質性。 scRNA-seq 最近已用于研究小鼠模型中柯薩奇病毒 B3 (CVB3) 誘導的心肌炎。拉斯拉多等人。報告骨髓細胞的炎癥表型、成纖維細胞在重塑和炎癥中的作用，以及細胞毒性 T 細胞在 CVB3 誘導的心肌炎中的作用。然而，本研究未探討病毒靶向的心肌細胞類型、基礎干擾素反應和先天免疫反應的細胞類型異質性以及轉錄程序的空間限制。
以前的研究聲稱病毒復制對心臟細胞的直接細胞病變作用是呼腸孤病毒誘導的心肌炎期間心臟損傷的主要原因。值得注意的是，發現呼腸孤病毒感染可在缺乏 B 和/或 T 細胞的免疫缺陷小鼠中誘發心肌炎，表明呼腸孤病毒誘導的心肌炎并不嚴格需要適應性免疫。然而，這些先前的實驗并不排除宿主適應性免疫反應可以增強或限制免疫能力小鼠中宿主損傷的性質和數量的可能性，正如我們的工作所建議的那樣。研究了先天免疫反應在呼腸孤病毒誘導的心肌炎中的保護作用。然而，在我們的工作之前，基礎 I 型 IFN 和先天免疫反應的時間、空間和細胞類型異質性尚未得到表征。宮本等人。和斯圖爾特等人。在體外比較了心肌細胞和成纖維細胞之間 I 型 IFN 的基礎水平，但這些研究并未包括構成復雜心臟組織的所有細胞類型。
病毒性心肌炎的時空特征對于了解對疾病病理學很重要的病毒和宿主因素至關重要。 這些知識最終可能會導致新的診斷方法和更好的治療方法。 幾種經常感染人類的病毒可引起心肌炎，包括腺病毒、腸道病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、人類皰疹病毒 6、細小病毒 B19 和 SARS-CoV2。 我們在這里實施的方法可用于未來的研究，以研究這些病毒誘導的心肌炎的誘導、病理生理學和病程有何不同。 希望我們在這里提供的數據和分析程序將成為此類未來研究的寶貴資源。
Method
Single-cell RNAseq data processing and visualization
Spatial transcriptomics data processing, integration, analysis, and visualization
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