單細胞測序&空間轉錄組，雙劍合璧，誰與爭鋒
編輯：ANIMUS
校對：ANIMUS
編者按：2020年初一場猝不及防的新冠肺炎疫情徹底改變了這個世界，也改變了我們每個人的工作和生活。傳染性呼吸系統病毒和疾病從未真正停止過，比如2003年的SARS，2015年的MERS和2020年的SARS-CoV-2。對于呼吸道感染相關病原菌及其宿主免疫機制的研究對于基礎科研和公共衛生具有重大戰略意義。
愛麗慕斯學術團隊專注于生命科學和醫學前沿進展，探索心腦血管疾病和癌癥等的致病基因、發病機制和藥物開發等。這里解讀應用單細胞測序和空間轉錄組技術，研究流感病毒感染肺組織的免疫分子機制，助力呼吸系統疾病前沿進展共享。
嚴重呼吸道感染可導致急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。目前尚無有效藥物可改善ARDS患者預后。宿主炎癥反應限制了病原體擴散并最終清除病原體，但免疫病理反應也導致了組織損傷和ARDS。呼吸道感染是導致疾病和死亡的主要原因。這些感染可導致ARDS并發肺水腫和缺氧，導致輕度到重度呼吸衰竭。病毒感染引起的肺損傷主要是由于免疫細胞浸潤，它殺死了感染細胞和周圍正常細胞。因此，深入研究病原體清除和免疫病理之間的平衡，可能有助于尋找改善ARDS2預后的策略。
2020年10月28日，Nature在線發表了由美國田納西州孟菲斯市圣猶大兒童研究醫院免疫學系Paul G. Thomas和Jeremy Chase Crawford，與廣州醫科大學第一附屬醫院廣州呼吸健康研究所鐘南山院士合作的文章，“Exuberant fibroblast activity compromises lung function viaADAMTS4”，利用10X單細胞測序，結合空間轉錄組，揭示了過度的成纖維細胞活性通過ADAMTS4損害肺功能，并提出ADAMTS4可作為病原菌感染的治療靶點。
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一、甲流病毒感染小鼠后CD45-細胞的單細胞基因表達譜
研究者采集了感染甲流病毒0天、1天、3天和6天的小鼠肺組織，分選CD45-細胞進行單細胞測序，鑒定到三個主要細胞群：成纖維細胞、上皮細胞和內皮細胞(圖1 a&b)。病毒mRNA的高表達，表明細胞受到高效感染，主要出現在I型肺細胞,纖毛上皮細胞和II型肺細胞。
成纖維細胞在感染后出現多種轉錄狀態(圖1c, d)。為評估每個簇中激活的通路，進行基因集富集分析(GSEA)，將每個簇與感染前基線簇(簇5)比較(圖1c)。根據基因表達特點，鑒定了三個主要功能：靜息（resting）、ECM合成和炎癥(圖1c)。ECM成纖維細胞(ESFibs)中富集到編碼ECM結構蛋白的基因，但缺乏炎癥信號相關基因的表達(圖1d)。炎性成纖維細胞高表達炎癥相關基因，而靜息成纖維細胞沒有顯著富集通路，主要涉及炎癥反應或ECM合成(圖1e)。
在炎性成纖維細胞中，鑒定出兩種不同的激活狀態，損傷反應成纖維細胞(DRFibs)和干擾素反應成纖維細胞(IRFibs)(圖1d)。最后通過分析五個人肺組織活檢發現人成纖維細胞活化狀態與小鼠的類似。
二、誰在調控成纖維細胞激活？
為尋找調節成纖維細胞激活的上游刺激因素，作者研究了人季節性病毒(H3N2)或禽流感病毒(H5N6或H7N9) 體外感染正常人支氣管上皮細胞(NHBEs)是否足以在共培養的人肺成纖維細胞中，產生一系列炎癥反應(圖2a)。NHBEs感染后誘導了成纖維細胞中大量炎癥基因表達，包括編碼細胞因子的基因(IL6)和幾種基質蛋白酶(ADAMTS4,MMP3和MMP13)。作者還關注了單個細胞因子和流感病毒在其自身培養的呼吸道細胞中引發的這些炎癥信號 (圖2a，單培養)，并將它們與流感病毒感染者的鼻腔清洗細胞(主要包括免疫細胞)進行比較。與NHBEs相比，成纖維細胞對IL-1細胞因子家族和TNF的刺激反應強烈，ECM相關基因廣泛上調(圖2a)。洗鼻細胞中ECM相關基因結構蛋白和基質蛋白酶低表達。
然而，鼻洗液和上皮細胞也表現出IL1A、IL1B和TNF高表達，表明它們可能向成纖維細胞傳遞免疫信號，從而調節ECM相關基因表達。
a，相對于mock對照組，感染組中基因表達（log2轉換后）平均變化倍數。共培養實驗中，每列代表一個生物學重復。對于單培養實驗，每列表示兩次重復刺激獨立實驗的平均值。
三、流感病毒感染后不同時間段的小鼠肺組織ECM蛋白酶的表達譜
為探索蛋白酶在肺修復中的作用，作者收集了流感病毒感染后不同時間段的小鼠肺組織勻漿，鑒定了ECM相關基因的表達(圖3)。ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液中ECM蛋白酶和組織抑制金屬蛋白酶(TIMPs)的表達量。ECM蛋白酶中，最早受誘導表達的是ADAMTS4——降解蛋白多糖versican的酶之一，其表達持續貫穿整個修復階段(圖3)。
根據scRNA-seq，ADAMTS4的表達僅限于非免疫的基質細胞(圖4c)。接下來作者對感染前后的免疫和非免疫細胞亞群進行了分類。感染前，ADAMTS4基因僅在成纖維細胞和內皮細胞表達。感染后，僅在成纖維細胞中觀察到ADAMTS4表達量顯著上調，作者認為這解釋了感染肺部中ADAMTS4的大量表達(圖2d)。
Meta分析顯示，在人類肺部疾病的一些數據集中，與健康對照組織相比，炎性肺疾病組織中ADAMTS4的表達顯著增加。
四、流感病毒感染后小鼠肺組織的空間基因表達譜
作者在呼吸窘迫高峰期(感染后10天(dpi))收集小鼠肺切片進行空間轉錄組，無監督聚類識別出肺部區域(紅色，簇0)與間質炎癥區域重疊(圖5)。與DRFibs相關的基因，包括ITGA5、LOX和ADAMTS4，在這些區域富集(圖5)。ADAMTS4的表達局限于肺泡附近的間質炎癥區。DRFib相關基因在支氣管區域(綠色，簇2)、淋巴高浸潤區(青色，簇3)和正常肺泡薄壁組織(黃色，簇1)低表達或不表達。總之，這些數據表明，當宿主感染病毒后開始恢復或病情惡化時，氣管遠端表達ADAMTS4的DRFibs發揮了重要作用。
五、ADAMTS4促進致命性免疫病理反應
為深入研究ADAMTS4對感染結果的影響，作者用致死劑量的甲型流感病毒對ADAMTS4野生型（WT）和ADAMTS4KO（KO）小鼠進行試驗。相比WT小鼠，ADAMTS4KO老鼠生存率顯著提高（圖6a），肺部病毒感染區域面積無顯著差異（圖6b），動脈氧飽和度更高，肺功能更好（圖6c & e）。在9 dpi時，ADAMTS4?KO小鼠的免疫細胞浸潤和肺泡炎癥顯著減少，肺組織損傷程度較小(圖3d)。
a，甲型流感病毒感染小鼠(WT, n=33, KO, n=23)的生存曲線。b，感染小鼠肺的代表性圖像和病毒傳播的定量。感染區域用紅色標出; c，3和6 dpi時動脈血氧飽和度(SpO2)。d，接近致死劑量病毒感染9 dpi時代表性圖像和組織學評分。e，接近致死劑量病毒感染氣道阻力。
六、ADAMTS4是人類流感感染的預測因子
作者在3個隊列中研究ADAMTS4對嚴重流感病毒感染的影響和作用。首先，基于兒童重癥流感(PICFLU)網絡中84名流感病毒感染兒童的多中心隊列，采集兒童重癥監護入院后72小時內收集的氣管內吸氣(ETA)樣本，分析了ECM蛋白酶和TIMPs水平。作者發現ADAMTS4與IL-1B和TNF水平呈正相關，而IL-1B和TNF是ADAMTS4表達的上游調節因子。
作者分析兒童隊列（PICFLU）發現ADAMTS4水平與相關疾病的嚴重程度顯著相關。而2個成人隊列（廣州隊列和臺灣隊列）中ECM蛋白酶、TIMP和細胞因子的調控模式與兒童隊列相似(圖7c)。并且，ADAMTS4主要位于下呼吸道中。
最后，作者分析后提出，下呼吸道中ADAMTS4蛋白水平是嚴重流感病毒感染后低氧呼吸衰竭和大范圍死亡的強有力預測因子(OR = 2.22, P = 3.1 × 10?5)。
a, PICFLU隊列分析物的相關矩陣。對于每個兩兩比較，顏色表示斯皮爾曼相關系數，而方框大小表示顯著性水平。分析物按層次聚類進行排序。b，以性別、既往健康、年齡和類固醇治療為協變量的VFD < 10的優勢比。c，臺灣和廣州隊列中每個患者從第一個可用時間點分析物的相關矩陣。d，以性別和年齡為潛在協變量的VFD < 10的比值比。b、d的優勢比采用多重檢驗的logistic回歸與FDR校正;陽性(紅色)或陰性(藍色)相關。
七、總結
本研究結合單細胞測序（scRNA-seq）和空間轉錄組（ST），研究了甲流病毒感染小鼠后CD45-細胞的單細胞和組織空間基因表達譜，發現呼吸道病毒感染誘導了成纖維細胞的三種不同激活狀態，即細胞外基質(ECM)合成，損傷反應和干擾素反應狀態。嚴重流感病毒感染時，肺成纖維細胞的過度活化可導致致命的免疫病理反應。通過產生ECM重構酶——特別是ECM蛋白酶ADAMTS4和炎癥細胞因子，損傷反應成纖維細胞以損害肺功能為代價，改變了肺微環境以提高免疫細胞浸潤。在三組呼吸道疾病隊列中，下呼吸道ADAMTS4水平與季節性或禽流感病毒感染的嚴重程度相關。靶向損傷反應性肺成纖維細胞ECM蛋白酶活性的治療藥物，可能為重癥呼吸道感染后保護肺功能和改善臨床結果提供新方案。
愛麗慕斯學術團隊，專業解讀心腦血管、腫瘤、呼吸系統疾病等各學科重磅文章。
下期預告：小編解析心臟發育的空間轉錄組Cell文章。
參考文獻
1. Boyd David F, Allen E Kaitlynn, Randolph Adrienne G et al. Exuberant fibroblast activity compromises lung function via ADAMTS4. Nature, 2020, 587: 466-471.
