首先來談第一個距離分析
關于空間上細胞距離的分析，其實談了很多了，大家可以參考我之前分享的文章空間轉錄組細胞類型的spot distance-based analyses，距離分析、空間轉錄組細胞類型的距離分析之二---代碼實現，其實關于距離分析，其實就是研究細胞位置的動態變化，無論在發育，還是在腫瘤中都有非常高的價值，我們繼續延伸一下這個分析的價值，以文章Integrative Analysis of Spatial Transcriptome with Single-cell Transcriptome and Single-cell Epigenome in Mouse Lungs after Immunization中的分析為例。
使用更新后的 scRNA-seq 數據和最終 15 種細胞類型，我們再次對四個切片中的每個點進行反卷積（單細胞空間聯合的方法這里就不多講了）。 箱形圖總結了四個切片中 15 種細胞類型的比例（說白了分析細胞含量的變化）。 我們進行了 t 檢驗以比較免疫（切片 A1 和 A2）和再次攻擊的小鼠（切片 A3 和 A4）之間的差異，發現每種細胞類型都有顯著差異。 一般來說，單核細胞較多，再次攻擊小鼠的巨噬細胞、樹突細胞、中性粒細胞、Th1 細胞和 NK 細胞。 相比之下，免疫小鼠有更多的 B 細胞、Th17 細胞和其他 T 細胞。
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在匯集來自免疫切片（切片 A1 和 A2）或再次攻擊的小鼠（切片 A3 和 A4）的spot后，計算比例矩陣列之間的 Pearson 相關系數。 在免疫小鼠和再次攻擊的小鼠中發現了不同細胞類型的顯著同點共存（上圖B）。 對于免疫小鼠，Th17 細胞、單核細胞和內皮細胞傾向于出現在相同的位置。 樹突細胞、B 細胞、成纖維細胞和其他 T 細胞 1 也彼此接近（空間距離）。 對于再次攻擊的小鼠，其他 T 細胞 1、B 細胞、Th17 細胞、Th1 細胞和樹突細胞經常出現在相同的位置。 雖然 Th1 細胞、NK 細胞和骨髓細胞在體內可能彼此接近。 每個切片單獨分析后，這些觀察結果保持不變（下圖）。
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氣道和血管的定位和分割在分析中很重要。 根據club cells和組織學血管的比例定義了氣道和血管（下圖）。
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在排除血管內的spot和與氣道距離超過 1,000 微米的spot后，我們根據公式計算了 Th17 和 Th1 細胞與氣道的加權距離（下圖）。
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在再次攻擊的小鼠中，發現 Th17 細胞比 Th1 細胞更靠近氣道，而 Th1 細胞更靠近免疫小鼠的氣道（下圖）。
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該結論與氣道和血管的定義無關，因為即使使用一組臨界值來定義這些結構，它也保持不變（下圖）。
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為了找到免疫細胞的空間分布模式，進行natural spline regression（關于回歸樣條，大家可以參考文章回歸樣條）以擬合免疫細胞比例與氣道距離之間的非線性關系。通常，B 細胞和其他 T 細胞靠近免疫小鼠的氣道，而中性粒細胞位于再次攻擊小鼠的氣道遠端（圖 4Ei-iv）。
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還對所有 15 種細胞類型進行了相同的分析（下圖）。
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在基因表達與氣道距離之間進行了natural spline regression。在免疫小鼠中鑒定出 3,655 個距離相關基因（兩個切片中 FDR 調整的 P 值 < 0.05），而在再攻擊小鼠中鑒定出 3,407 個。對這些距離相關基因進行了基因 (GO) 富集分析。免疫小鼠有 1,293 個顯著（FDR 調整 P 值 < 0.05）過度表達的生物過程被識別，1,294 個通路被再次攻擊的小鼠識別。重新攻擊小鼠的前 50 名（按倍數富集分層排序）過度代表的生物過程包括許多免疫反應（例如，免疫細胞的增殖、分化、激活、聚集、粘附和趨化性）。相比之下，在免疫小鼠中幾乎沒有過度表達的免疫反應。 Ccl20 是一種頂級距離相關基因，在再次攻擊的小鼠而非免疫小鼠的氣道周圍高度表達（下圖）。
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由于 CCL20 能夠與 CCR6（一種在 Th17 細胞上表達的趨化因子受體）結合，這一發現可能解釋了為什么 Th17 細胞比再次攻擊的小鼠中的 Th1 細胞更靠近氣道。
我們來看看具體的做法
對于所有基于距離的分析，定義為血管的spot和與氣道的距離超過 1,000 微米的spot被排除在外。由于血管內的細胞與肺實質中的細胞不同，而且包括氣道極遠側細胞在內的分析不穩定，因為每個切片的捕獲面積僅為 6.5 x 6.5 mm2。只有少數spot與氣道的距離超過 1,000 微米（切片 A1 為 5.89%，切片 A2 為 5.75%，切片 A3 為 15.00%，切片 A4 為 11.43%）。
Th17 和 Th1 細胞到氣道的加權距離根據公式計算在四個切片中，考慮到每個spot到最近氣道的距離以及每個點中 Th17 和 Th1 細胞的比例。為了找到細胞類型的空間分布模式，進行了自然樣條回歸（具有三個自由度）以擬合細胞類型比例與氣道距離之間的非線性關系。
為了識別距離相關基因，為每個切片中到氣道的距離構建了自然樣條（具有三個自由度）并創建了設計矩陣。然后，我們在標準化基因表達矩陣中為每個基因擬合線性模型，并調用 R 包 limma以加快過程。使用 Benjamini-Hochberg 校正對每個切片中每個樣條的 P 值進行多次測試校正。對于至少一個樣條，其 FDR 調整 P 值 < 0.05 的基因被認為在該切片中是顯著的。將免疫切片（切片 A1 和 A2）或再次攻擊的小鼠（切片 A3 和 A4）的兩個切片中的顯著基因定義為距離相關基因。
接下來談第二個問題，空間通訊的問題，其實關于空間的通訊分析，之前也分享了很多了，大家可以參考文章10X空間轉錄組做細胞通訊的打開方式、空間通訊分析章節2、10X空間轉錄組通訊分析章節3等等，就不給大家一一列舉了。
為了進行細胞間通訊網絡分析，根據細胞類型比例的等級確定了細胞類型富集點（下圖，空間位點注釋）
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同一小鼠的兩個切片之間幾乎沒有差異（下圖）。
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由于難以解釋與它們的相互作用，成纖維細胞、內皮細胞和紅細胞未包括在分析中。
使用 CellChat（下圖）
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在每個切片中推斷出細胞類型富集點之間的細胞間通訊網絡。 為了比較再次攻擊和免疫小鼠之間通信模式的差異，熱圖顯示了細胞類型富集點之間的不同相互作用強度（下圖）。
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在再次攻擊的小鼠中，骨髓細胞、Th1 細胞和 Th17 細胞之間的交流增加，我們的同點共現分析（這個分析就是共定位分析）也揭示了這一點。 對于免疫小鼠，樹突狀細胞可能是通信信號的主要發送者，而 B 細胞和其他 T 細胞是信號的重要接收者。
保守的和上下文特定的信號通路通過條形圖被識別和可視化（下圖）。
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TNF通路僅在再次攻擊的小鼠中開啟，而CXCL和CCL通路增加。在空間轉錄組的細胞-細胞通訊分析中確認了一些眾所周知的信號通路，優于scRNA-seq數據的細胞-細胞通訊分析。隨著空間轉錄組學分辨率的發展，這種分析的性能可能會更好。我們發現再攻擊小鼠的 Th17 富集點是 IL6 信號通路的接收者，因為受體基因 Il6ra 在切片 A3 和切片 A4 的 Th17 富集點中高度表達（下圖）。
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利用 scATAC-seq 數據，我們確認巨噬細胞和樹突細胞是 IL6 信號的來源，而 Th17 細胞是靶標。對于 TGF-β 信號通路，我們還發現再次攻擊小鼠的 Th17 富集點是其受體，受體基因 Tgfbr1、Tgfbr2 和 Acvr1b 在切片 A3 和切片的 Th17 富集點中高度表達A4（下圖）。
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通過檢查這些受體基因周圍基因組區域的峰值，證實 Th17 細胞具有表達 TGF-β 信號受體的能力。這些數據表明，空間轉錄組學數據可以外推并用于進行細胞間通訊網絡分析。
看看具體的做法
使用 CellChat進行細胞間通訊分析。 在運行 R 包 CellChat之前，處理了四個切片的空間轉錄組，使用歸一化的基因表達矩陣，提取細胞類型富集點的注釋并保存在 CellChat對象中。 來自免疫（切片 A1 和 A2）或再次攻擊小鼠的兩個切片的處理數據也匯集在一起并保存在 CellChat對象中，以比較兩只小鼠之間的差異。
加載了人工管理的小鼠配體-受體相互作用數據庫進行分析。 所有配體-受體相互作用，包括旁分泌/自分泌信號相互作用、細胞外基質 (ECM)-受體相互作用和細胞-細胞接觸相互作用，都包括在分析中。 （cellchat自身的數據庫）。
首先為每個 CellChat 對象中的每種類型的細胞類型富集點鑒定顯著表達的配體或受體。如果配體或受體顯著表達，也可以鑒定顯著表達的配體-受體相互作用。然后，我們根據默認設置計算通訊概率并推斷cellular communication network。通過總結與每個信號通路相關的所有配體-受體相互作用的通訊概率來計算信號通路水平的通訊概率。通過計算鏈接數或匯總通訊概率計算聚合的細胞 - 細胞通信網絡并在四個切片中進行可視化
使用熱圖。
為了弄清楚在再次攻擊的小鼠與免疫小鼠中哪種類型的細胞類型富集點相互作用發生了顯著變化，使用熱圖識別并可視化了不同的相互作用強度。通過比較每個信號通路的信息流來識別保守的和上下文特定的信號通路，這是由網絡中的總權重定義的。使用 CellChat netVisual_aggregate 函數通過圓形圖顯示選定的信號通路（cellchat的默認函數都可以實現）。
最后補充一個分析，Same-spot Co-occurrence Analysis
在每個切片中計算比例矩陣的列（表示不同的細胞類型）之間的 Pearson 相關系數，以廣泛評估同一地點的空間細胞類型共存。 將免疫切片（切片 A1 和 A2）或再次攻擊的小鼠切片（切片 A3 和 A4）中的斑點分別合并在一起，還計算了它們的 Pearson 相關系數。 相關 r 矩陣分層聚類并在熱圖中可視化（下圖）。
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