https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/tpj.13073

• Ribosome profiling reveals dynamic translational landscape in maize seedlings under drought stress

總結：

• 植物可以通過各種機制在轉錄和翻譯水平上對環境變化做出反應。到目前為止，人們對植物在轉錄水平上的脅迫反應已有了較為廣泛的認識，而在翻譯水平上對植物的脅迫反應知之甚少。為了揭示植物在干旱脅迫下的翻譯情況，我們對正常和干旱條件下生長的玉米幼苗進行了Ribo-seq測序。對Ribo-seq數據和RNA-seq數據的比較分析表明，在轉錄水平上，基因表達的倍性變化與翻譯水平的變化呈中度相關(R2=0.69)。然而，在干旱條件下，只有不到一半的響應基因被轉錄和翻譯所共享，這表明干旱脅迫可以獨立地引起轉錄和翻譯反應。我們發現在干旱脅迫下，931個基因的翻譯效率發生了明顯的變化。進一步分析表明，基因的翻譯效率受其序列特征(GC含量、編碼序列長度和歸一化最小自由能)的影響較大。此外，我們在2558個基因上檢測到3063個上游開放閱讀框架(uORFs)的潛在翻譯，這些uORFs可能影響下游主要開放閱讀框架(mORFs)的翻譯效率。我們的研究表明，植物對干旱脅迫的反應具有高度動態的翻譯機制，并與轉錄反應具有協同作用。

關鍵詞：maize, ribosome profiling, RNA-seq, drought stress, translational efficiency, uORF

簡介

Ribosome profiling

• 該方法可通過對核糖體結合的mRNA片段（RPF）的深度測序提供蛋白質合成的單核苷酸分辨率測量

• 技術來源于2009的一篇sicence
  Genome-Wide Analysis in Vivo of Translation with Nucleotide Resolution Using Ribosome Profiling
  

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• 建庫流程，簡單的來說就是只將核糖體結合的RNA（即正在翻譯的RNA）拉下來進行建庫，而不同于RNA-seq建庫（將所有的RNA進行建庫）

  
  
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• 詳細視頻講解見翻譯組介紹與應用
  

• 在植物中首先運用于擬南芥中研究光形態問題

涉及縮寫

• uORF：upstream open reading frame
• WW：well-watered
• DS ：drought-stressed

Result

一、 數據的產生以及Ribo-seq數據的特征

• 本文Ribo-seq建庫方法

  
  
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測序量如下，可以明顯看到Ribo-seq所需要的測序量很高，而且由于大量的rRNA最終比對上的有效的Reads大約只有12%。

• Ribo-seq測序量：
  • WW seedlings：240 million reads
  • DS seedlings: 150 million reads
• RNA-seq測序量：
  • WW seedlings：32 million reads
  • DS seedlings : 48 million reads

• 數據的重復性高達0.9+

  
  
• 進一步分析RFP長度分析，發現都主要分布在30bp（Fig2 a）左右, 與之前的報道基本一致，但是與酵母中報道的28nt略長。在翻譯過程中，核糖體一次推進三個核苷酸，同時作者本文中也在開始密碼子后和終止密碼子前也觀察到了一個很強的三核苷酸周期性(Fig2 b)。在WW幼苗中RPF主要位于CDS區（97.5%）,其次是5'UTR(2.1%)和3'UTR(0.4%) (Fig2 d)。而在經歷drought后DS中，RPF主要位于CDS區（95.9%）,其次是5'UTR(3.6%)和3'UTR(0.5%) (Fig2 d)。表明在UTR中特別是5'UTR上有潛在的翻譯能力。
  
  Fig 2

二、干旱脅迫改變翻譯水平和轉錄水平的表達

• 差異基因數目統計（Fig3 a）
• 轉錄水平： 1646 up 2870 down
• 翻譯水平： 1779 up 3832 down

• 為了進一步確認轉錄水平在干旱脅迫后受到抑制，與WW苗相比，DS苗中的多體比例從49.9%下降到33.9%，單體比例從34.9%上升到48%，說明DS幼苗中的翻譯受到全基因組的抑制。

  
  
  Fig 3
• 作者計算了轉錄組數據和Ribo-seq數據兩者的相關性為0.69。進一步將基因分類，發現59%響應的基因屬于C類和G類（轉錄水平與翻譯水平變化一致）（Fig 4）
  
  Fig 4

三、干旱脅迫導致大量基因的翻譯效率發生顯著變化

• TE(Translational efficiency） = FPKMribosome-profiling / FPKMRNA-seq, 翻譯效率TE代表RNA的使用率。
• 全基因組分析TE， 發現基因的TE變幅達4000倍以上，表明大量基因經歷了高度動態的翻譯調控(Fig5 a), 作者觀察到與光合作用有關的基因的轉錄豐度(P值=6.45e-13)和TE(P-值=2.64e-08)都比在幼苗中表達的所有其他基因的轉錄豐度高(P值=6.45e-13)和更高的TE(P-值=2.64e-08)(圖5a)。這些光合作用相關基因的表達增加，表明它們除了具有較高的活性外，還具有更高的翻譯效率。
  
  Fig 5
• 作者猜想植物是否能夠通過翻譯效率的變化來對干旱脅迫做出反應？干旱處理后，作者檢測到538個TE降低的基因(小于2.8倍，z評分<2)和393個TE增加的基因(大于2.7倍，z評分>2)(Fig5 b)，說明調節基因翻譯效率可能是植物逆境反應的重要途徑。

四、基因的翻譯效率受其序列特征的影響。

• 據報道，基因的序列特征有助于增加與多核糖體體相關的mRNAs的比例，并進一步影響蛋白質的豐度。作者研究了CDS、3'UTR和5'UTR基因的三個序列特征(序列長度、歸一化最小自由能(NMFE)和GC含量)，并估計了它們對相應基因翻譯效率的潛在影響。
  • 對于CDS: 翻譯效率較高(log2(TE)>1)的基因具有較短的長度、較高的GC含量和較低的NMFE。
  • 對于3'UTR: 較高的翻譯效率基因和較低的翻譯效率基因之間的差異相對較小。在3'UTR中，只有最高翻譯效率組(Log2(TE)>1)的基因具有較短的長度、較高的GC含量和較低的NMFE。
  • 對于5'UTR：翻譯效率較高的基因(log2(TE)>1)具有較短的長度、較低的GC含量和較高的NMFE。
• 接下來，作者檢查具有一致和不一致表達模式的基因的序列特征是否不同。基于Kolmogorov-Smirnov檢驗(KS檢驗)，累積曲線表明，與非協調組(Fig 3c 中非重疊部分的基因)相比，位于同一組(Fig 3c 中重疊部分的基因)的基因在CDS中的GC含量(P值=3.7e-11)趨向于較高的GC含量(P-value=1.6e-12)和低NMFE(P-value=1.6e-12)(圖3c中的非重疊部分的基因)(Fig 6b、c).。此外，50個UTR中GC含量較低的基因往往受到一致的調控(P-值=1.2e-4；圖S9j)。
  
  Fig 6

五、廣泛的上游開放閱讀框架(UORF)

• 缺水使5'UTR中RPFs的比例增加了1.7倍(Fig 2d)，暗示著5'UTR的某些元件可以參與脅迫的應答。而uORF(位于5'UTR區的小ORF)已報道能夠抑制下游主要的ORFs(mORFs)的翻譯(by reinitiation and leaky scanning and have been identified in several organisms)。在玉米中之前只有兩個經典的含uORF的基因被報導。而通過Ribo-seq可以從全基因組上去鑒定這種含有uORF的基因。
• 作者首先基于玉米基因組中存在AUG起始密碼子的基因，進行了uORF預測。為了更準確地鑒定含有uORF的基因，我們對過濾得到的基因集(FGS)中的26 971個玉米基因進行了研究，這些基因與其他4個草種(水稻(Oryza Sativa)、短腿草(Braqupodium Distthon)、谷子(Setaria Italica)和高粱(Sorghum Bicolor)是共線性的。得到7927個含有uORF的基因(平均每個基因含有2個uORF, 長度平均為36bp)。進一步進行過濾，得到2558（including 45 classical genes like Lc)個基因，這些基因包含3063個平均長度為105bp的核糖體結合的uORF。
  

六、翻譯后的uORF抑制了mORF的翻譯

• 作者為了鑒別翻譯的和未翻譯的uORF之間的特征差異，比較了與mORF重新啟動有關的三個參數：uORF長度、5'uTR的長度和NMFE。作者發現翻譯后的uORF比未翻譯的具有更長的長度(P值<2.2e-16)和更強的折疊能力(P值<2.2e-16) (Fig 7a、c)。然而，帶有翻譯的uORFs的基因顯示出較短的5'UTR長度 （Fig7 b）。翻譯的uORFs從uORF到mORFs起始密碼子的相對距離(P<2.2e-16)和從uORF到轉錄起始位點(TSS)(轉錄起始位點，P=1.4e-9)的相對距離都較短(Fig7 d、e)。
• 在翻譯后的uORFs中，鳥嘌呤在-3(P-值=0.02)和+4(P-值=3.0e-4)位置的概率高于未翻譯的uORF(P-值=0.02)。
• 與未翻譯的uORFs相比，翻譯的uORFs顯著降低了相應基因的TE(Fig7 g)。此外，翻譯的uORFs數量的增加進一步促進了TE的減少。
• uORFs被報導響應糖信號 (Wieseet al., 2004)、光 (Liu et al., 2013)and 病原菌的侵染(Pajerowska-Mukhtar et al., 2012)。作者檢測了在干旱后uORF的翻譯效率，發現相對于正常的幼苗，uORF的翻譯效率要高。說明玉米在干旱脅迫下uORFs的翻譯在全基因組范圍內都得到了增強（Fig7 h）。TE效率增加的uORF的比例與位于5'UTR中RFPs增加的比例一致(Fig 2d)。
  
  Fig 7

Ribo-seq分析本文提供圖

Ribo-seq相關分析方法

• reads過濾：fastq_illumina_filter 使用參數-keep N -v 保留最佳質量的reads。
• Adapter切除：fastx_clipper 使用參數-Q 33 -a CTGTAGGCACCATCAAT -l 25 -n -v進行切除，然后在使用fastx_trimmer使用參數-Q 33 -f 2 去除每次讀取的5'端第一個核苷酸（原因是它在逆轉錄過程中經常代表一個未模板化的加成。）。
• rRNA過濾：從NCBI下載rRNA序列信息，然后bowtie使用參數–chunkmbs 1000 -un -al去除由于rRNA造成的污染。
• Tophat2 比對：將玉米B73的基因組序列通過Tophat2使用參數–bowtie1 -N 2 -I 50000 -p 3進行比對
• 翻譯豐度的計算：通過Cufflinks使用參數–p 3 -G -u來進行計算，只考慮比對到CDS上的reads, FPKM最終來衡量每個基因的翻譯豐度。
• 翻譯效率計算: 只考慮FPKM ≥ 1的基因進行樣本間的重復性和進行后續分析。
  • TE = FPKM_{(translational_level)} / FPKM_{(transcriptional_level)}
• 3堿基周期性圖: i = 4 * read number i/((read number (i - 2) + read number (i - 1) + read number (i + 1) + read number (i + 2)), 然后繪制每個點對應的圖
• Normalized minimal free energy (NMFE)計算：定義二級結構的序列穩定性，它由RNAfold計算，并由序列長度規格化
• uORF預測：predict uORFs with the sequence structure of (ATG-3n-TAG|TAA|TGA), 通過uORF的FPKM值是否大于1分類為表達和不表達。
• motif圖繪制：Seqlogo

個人比較震撼的是文中在干旱脅迫后由5'UTR區的RFPs的比例增加，通過文獻的積累想到5'UTR區的uORF對脅迫的響應并且對下游mORFs的翻譯效率的影響。這篇文章應該是植物中分析Ribo-seq數據，特別是這種兩兩比較翻譯效率變化等的必看的一篇文獻吧, 最后提醒的是本文是發表于15年，所以這篇文章的數據開始分析時候肯定在15年之前甚至更早，所以這篇文章中很多軟件都比較老，所以方法借鑒就好，新的工具自己通過經驗和文獻來更新。