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Cicero是一個單細(xì)胞染色質(zhì)可及性實(shí)驗(yàn)可視化R包。Cicero的主要功能就是使用單細(xì)胞染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)通過分析共開放去預(yù)測基因組上順式調(diào)節(jié)作用(cis-regulatory interactions)，例如增強(qiáng)子和啟動子。Cicero能夠利用染色質(zhì)開放性進(jìn)行單細(xì)胞聚類，排序和差異可及性分析。關(guān)于Cicero的算法原理，參考他們發(fā)表的文章.
簡介
Cicero的主要目標(biāo)是使用單細(xì)胞染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)去預(yù)測基因組上那些在細(xì)胞核中存在物理鄰近的區(qū)域。這能夠用于鑒定潛在的增強(qiáng)子-啟動子對，對基因組順式作用有一個總體了解。
由于單細(xì)胞數(shù)據(jù)的稀疏性，細(xì)胞必須根據(jù)相似度進(jìn)行聚合，才能夠?qū)?shù)據(jù)中的多種技術(shù)因素進(jìn)行可靠糾正。
最終，Cicero給出了"Cicero 共開放"得分，分?jǐn)?shù)在-1和1之間，用于評估用于給定距離中每個可及peak對之間的共開放性，分?jǐn)?shù)越高，越可能是共開放。
此外，Monocle3的框架讓Cicero能對單細(xì)胞ATAC-seq實(shí)驗(yàn)完成Monocle3上的聚類，擬時間等分析。
Cicero主要提供了兩種核心分析:
- 構(gòu)建和分析順式調(diào)控網(wǎng)絡(luò).
- 常規(guī)單細(xì)胞染色質(zhì)可及性分析:
Cicero安裝和加載
Cicero運(yùn)行在R語言分析環(huán)境中。盡管能夠從Bioconductor安裝，但是推薦從GitHub上安裝。
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install(c("Gviz", "GenomicRanges", "rtracklayer"))
install.packages("devtools")
devtools::install_github("cole-trapnell-lab/cicero-release", ref = "monocle3")
加載Cicero
library(cicero)
數(shù)據(jù)加載
Cicero以cell_data_set(CDS)對象存放數(shù)據(jù)，該對象繼承自Bioconductor的SingleCellExperiment對象。我們可以用下面三個函數(shù)來操縱數(shù)據(jù)
- fData: 獲取feature的元信息, 這里的featureI指的是peak
- pData: 獲取cell/sample的元信息
- assay: 獲取cell-by-peak的count矩陣
除了CDS外，還需要基因坐標(biāo)信息和基因注釋信息。
關(guān)于坐標(biāo)信息，以mouse.mm9.genome為例，它是一個數(shù)據(jù)框，只有兩列，一列是染色體編號，另一列對應(yīng)的長度
data("mouse.mm9.genome")
基因組注釋信息可以用rtracklayer::readGFF加載
temp <- tempfile()
download.file("ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-65/gtf/mus_musculus/Mus_musculus.NCBIM37.65.gtf.gz", temp)
gene_anno <- rtracklayer::readGFF(temp)
unlink(temp)
Bioconductor也有現(xiàn)成的TxDb，可以從中提取注釋信息。
簡單稀疏矩陣格式
以一個測試數(shù)據(jù)集介紹如何加載簡單稀疏矩陣格式
temp <- textConnection(readLines(gzcon(url("http://staff.washington.edu/hpliner/data/kidney_data.txt.gz"))))
cicero_data <- read.table(temp)
這里的簡單稀疏矩陣格式指的是數(shù)據(jù)以三列進(jìn)行存放，第一列是peak位置信息，第二列是樣本信息，第三列則是樣本中有多少fragment和該peak重疊。
chr1_4756552_4757256 GAATTCGTACCAGGCGCATTGGTAGTCGGGCTCTGA 1
對于這種格式，Cicero提供了一個函數(shù)make_atac_cds, 用于構(gòu)建一個有效的cell_data_set對象，用于下游分析，輸入既可以是一個數(shù)據(jù)框，也可以是一個文件路徑。
input_cds <- make_atac_cds(cicero_data, binarize = TRUE)
10X scATAC-seq 數(shù)據(jù)
如果數(shù)據(jù)已經(jīng)經(jīng)過10X scATAC-seq處理，那么結(jié)果中的filtered_peak_bc_matrix里就有我們需要的信息
加載cell-by-peak count矩陣，
# read in matrix data using the Matrix package
indata <- Matrix::readMM("filtered_peak_bc_matrix/matrix.mtx")
# binarize the matrix
indata@x[indata@x > 0] <- 1
加載cell元數(shù)據(jù)
# format cell info
cellinfo <- read.table("filtered_peak_bc_matrix/barcodes.tsv")
row.names(cellinfo) <- cellinfo$V1
names(cellinfo) <- "cells"
加載peak元數(shù)據(jù)
# format peak info
peakinfo <- read.table("filtered_peak_bc_matrix/peaks.bed")
names(peakinfo) <- c("chr", "bp1", "bp2")
peakinfo$site_name <- paste(peakinfo$chr, peakinfo$bp1, peakinfo$bp2, sep="_")
row.names(peakinfo) <- peakinfo$site_name
為cell-by-peak的count矩陣增加行名(peak元數(shù)據(jù))和列名(cell元數(shù)據(jù))
row.names(indata) <- row.names(peakinfo)
colnames(indata) <- row.names(cellinfo)
然后用new_cell_data_set根據(jù)peak元數(shù)據(jù)，cell元數(shù)據(jù)構(gòu)建出一個cell_data_set對象
# make CDS
input_cds <- suppressWarnings(new_cell_data_set(indata,
cell_metadata = cellinfo,
gene_metadata = peakinfo))
之后用detect_genes統(tǒng)計(jì)，對于每個基因在多少細(xì)胞中的表達(dá)量超過了給定閾值。
input_cds <- monocle3::detect_genes(input_cds)
過濾沒有細(xì)胞開放的peak
input_cds <- input_cds[Matrix::rowSums(exprs(input_cds)) != 0,]
構(gòu)建順式作用網(wǎng)絡(luò)
運(yùn)行Cicero
構(gòu)建Cicero CDS對象
因?yàn)閱渭?xì)胞染色質(zhì)開放數(shù)據(jù)特別稀疏，為了能夠比較準(zhǔn)確的估計(jì)共開放得分，需要將一些比較相近的細(xì)胞進(jìn)行聚合，得到一個相對比較致密的count數(shù)據(jù)。Cicero使用KNN算法構(gòu)建細(xì)胞的相互重疊集。而細(xì)胞之間距離關(guān)系則是根據(jù)降維后坐標(biāo)信息。降維方法有很多種，這里以UMAP為例
input_cds <- detect_genes(input_cds)
input_cds <- estimate_size_factors(input_cds)
# PCA或LSI線性降維
input_cds <- preprocess_cds(input_cds, method = "LSI")
# UMAP非線性降維
input_cds <- reduce_dimension(input_cds, reduction_method = 'UMAP',
preprocess_method = "LSI")
此時用reducedDimNames(input_cds)就會發(fā)現(xiàn)它多了LSI和UMAP兩個信息，我們可以用reducedDims來提取UMAP坐標(biāo)信息。
umap_coords <- reducedDims(input_cds)$UMAP
make_cicero_cds函數(shù)就需要其中UMAP坐標(biāo)信息。
注1: 假如你已經(jīng)有了UMAP的坐標(biāo)信息，那么就不需要運(yùn)行preprocess_cds和reduce_dimension， 直接提供UMAP坐標(biāo)信息給make_cicero_cds就可以了。
注2: umap_coords的行名需要和pData得到表格中的行名一樣, 即all(row.names(umap_coords) == row.names(pData(input_cds)))結(jié)果為TRUE。
cicero_cds <- make_cicero_cds(input_cds, reduced_coordinates = umap_coords)
此時的cicero_cds是沒有UMAP降維信息。
運(yùn)行Cicero
Cicero包的主要功能就是預(yù)測基因組上位點(diǎn)之間的共開放. 有兩種方式可以獲取該信息
-
run_cicero: 一步到位。默認(rèn)參數(shù)適用于人類和小鼠，但是其他物種，參考此處 - 單獨(dú)運(yùn)行每個函數(shù)，這樣子獲取中間的信息。
#測試部分?jǐn)?shù)據(jù)
data("mouse.mm9.genome")
sample_genome <- subset(mouse.mm9.genome, V1 == "chr2")
sample_genome$V2[1] <- 10000000
conns <- run_cicero(cicero_cds, sample_genome, sample_num = 2)
nrow(conns) # 212302
## 全部數(shù)據(jù), 時間真久
conns <- run_cicero(cicero_cds, mouse.mm9.genome, sample_num = 2)
nrows(conns) #59741738
其中conns存放的是peak之間共開放得分。
