別人的筆記http://mooc.guokr.com/note/19064/
Lecture 1: Transcription and Assays
Segment 1: Introduction to Transcription
研究轉(zhuǎn)錄需要搞清：RNA聚合酶如何識(shí)別基因（特異性）和一個(gè)基因該以什么頻率進(jìn)行轉(zhuǎn)錄（效率）。
第一部分分子生物學(xué)原理內(nèi)容回顧
A promoter is the site that directs RNA polymerase to bind a gene. The transcription start site is usually at the downstream end of a promoter. A transcript encodes a protein, which requires that the translation start and termination sites must be within the area defined by the transcription start and termination sites.
Segment 2: Requirements for Transcription
雙鏈ＤＮＡ模板。模板鏈指導(dǎo)ｒＮＴＰ 的合成，非模板鏈不指導(dǎo)。
Segment 3: Assaying Transcription - Incorporation Assay
分析轉(zhuǎn)錄本。使用標(biāo)記過(guò)的ｒＮＴＰ摻入以分析，所以叫Incorporation。其中有兩個(gè)問(wèn)題：
１. 把ＲＮＡ產(chǎn)物從標(biāo)記的ｒＮＴＰ中分離出來(lái)：濾紙結(jié)合分析法（不能提示長(zhǎng)度信息也不能確切定位轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)）和凝膠電泳（根據(jù)產(chǎn)物的大小，如果是幾百核苷酸的 可以用瓊脂糖膠；或如果產(chǎn)物更小，可以是丙烯酰胺凝膠；通過(guò)加入尿素防止ＲＮＡ的折疊）
２. 雖然起始點(diǎn)精確，但終止點(diǎn)不精確：為解決這一問(wèn)題就可以在體外做 transcription runoff assay，失控轉(zhuǎn)錄分析，就是有一個(gè)限制酶切位點(diǎn)使得聚合酶在模板末端脫落，從而使得終止點(diǎn)相同。
Segment 4: Transcription Start Sites - Primer Extension引物延伸 1
測(cè)定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的第一種方法：引物延伸實(shí)驗(yàn)。
- 抽提RNA
- DNA探針。要有熒光標(biāo)記 可以標(biāo)記dNTPs or the DNA primer、DNA primer引物需要20-25個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
- 雜交
- 延伸引物，使用逆轉(zhuǎn)錄酶。當(dāng)它延伸到轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的時(shí)候會(huì)脫落。使用逆轉(zhuǎn)錄酶最好采用RT isolated from a virus infecting thermophilic bacteria and reverse transcribed at 60°C，因?yàn)楦邷貢?huì)移除RNA中可能的二級(jí)結(jié)構(gòu)，是的逆轉(zhuǎn)錄酶在RNA的末端終止。
- 使用丙烯酰胺凝膠分離
TSS就是要測(cè)定的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) transcription start site
Segment 5: Transcription Start Sites - Primer Extension 2
一個(gè)例子。TSS（Transcription Start Sites）永遠(yuǎn)位于Translation Start Sites(也稱(chēng)為start codon)的上游（即5‘端）。引物為61-81之間的長(zhǎng)度，引物增長(zhǎng)后再TSS位置處斷裂，發(fā)現(xiàn)是192個(gè)長(zhǎng)度。
------------------------111 bases from TSS to Start Codon
----------------------------------------- 192bases
0 61---------81 DNA PRIMER
5‘----------------------------------------------------------------- RNA 3
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TSS Start Position of
Codon the Primer
Segment 6: Gene By Gene Expression - Reverse Transcriptase-PCR
檢測(cè)單基因表達(dá)量最常用的方法。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中引入PCR
Segment 7: Gene By Gene Expression - Real Time-PCR
用一種能與產(chǎn)物雙鏈DNA結(jié)合的染料，你就能看到染料越來(lái)越濃，顏色變深體現(xiàn)了產(chǎn)物生成過(guò)程。但是需要設(shè)置對(duì)照組，比如看管家基因actin的表達(dá)量，以排除掉污染。
Segment 8: Global Transcription - The Process of RNA-Seq
前面的方法只能研究一個(gè)基因，下面介紹全測(cè)序的方法，RNA-Seq
cDNA: copy DNA(complementory DNA)。由mRNA逆轉(zhuǎn)錄而來(lái)，接下來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增、剪切、測(cè)序。
Segment 9: Global Transcription - The Data of RNA-Seq
Segment 10: Global Transcription - GRO-Seq 1
Global run on seq
GRO-seq是觀(guān)察單個(gè)基因轉(zhuǎn)錄速率最直接的方法
Segment 11: Global Transcription - GRO-Seq 2
優(yōu)點(diǎn)是會(huì)獲得正在進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄信息
Lecture 2: Mechanism of Bacterial Transcription
Segment 1: The Structure of 細(xì)菌的RNA Polymerase聚合酶
Segment 2: The Activity of RNAP（RNA聚合酶的核心部分） and RNAP(holo)
RNAP需要一條DNA和一個(gè)缺口才工作、非特異的。
而RNA聚合酶的第五個(gè)亞基決定了特異性。叫做σ因子，可以識(shí)別啟動(dòng)子序列。σ因子+RNAP=全酶RNAP(holo)。
RNAP(holo)可以從啟動(dòng)子開(kāi)始轉(zhuǎn)錄而RNAP不能。
Segment 3: Anatomy 解剖of a Bacterial Promoter啟動(dòng)子
RNA通過(guò)啟動(dòng)子的功能部件貼到DNA上
Segment 4: Mapping Bacterial Promoters
The promoter mapping strategy follows the same principal as the replicator mapping strategy you learned in 7.28.1x. Because the promoter will be adjacent to the transcription start site, the first step is to map the transcription start site, which one could do using a primer extension assay. Next you mutagenize suspected regions of importance and then assay the mutants for function. Loss-of-function indicates an integral part of the promoter. Crosslinking sigma to DNA would be a step of a ChIP protocol.
檢測(cè)突變的實(shí)驗(yàn)：promoter fusion assay。把啟動(dòng)子融合到一個(gè)產(chǎn)物蛋白質(zhì)很容易被檢測(cè)的基因上，比如GFP(發(fā)綠光）或者LacZ
