自閉癥譜系障礙（Autism spectrum disorder，ASD）是一種神經發育障礙，以社交溝通障礙和刻板行為為主要特征。許多研究證明，妊娠期暴露于環境毒素會導致兒童中ASD患病率快速增長。1-硝基芘（1-Nitropyrene，1-NP）一種主要存在于柴油排放顆粒（DEPs）和烹飪排放中的特征性硝基多環芳烴（nitro-PAH）。早期報告顯示，妊娠晚期暴露于1-NP（10 μg/kg）與子代青少年學習力和記憶力下降有關。整個妊娠期暴露于1-NP（10、100 μg/kg）引起了子代成年階段的焦慮樣行為。盡管這些神經系統疾病與1-NP暴露有關，但目前尚不清楚母親1-NP暴露是否在子代中誘導自閉癥樣行為。

越來越多證據表明內側前額葉皮層（medial prefrontal cortex，mPFC）中的中間神經元在社交溝通調節中發揮關鍵作用，中間神經元遷移遲緩導致小鼠出現自閉癥樣行為。一些研究表明，羥甲基化修飾參與胎盤滋養層細胞和神經干細胞遷移。那么產前1-NP暴露是否會通過抑制與中間神經元遷移相關基因的羥甲基化修飾來抑制中間神經元遷移呢？

2024年5月16日，安徽醫科大學碩士研究生趙婷為第一作者、合肥工業大學黃程青博士和安徽醫科大學張醫浩副教授為共同第一作者，安徽醫科大學公共衛生學院徐德祥教授為通訊作者、王博副教授為共同通訊在《Advanced Science》（Adv Sci）期刊發表題為“Prenatal 1-Nitropyrene Exposure Causes Autism-Like Behavior Partially by Altering DNA Hydroxymethylation in Developing Brain”的研究論文，研究通過APOBEC-coupled epigenetic sequencing（ACE-seq）和RNA-seq多組學分析揭示了母體孕期1-NP暴露會通過改變發育大腦中與中間神經元遷移相關的DNA羥甲基化調控下游基因表達，進而介導子代出現自閉癥樣行為表型。此外，研究還表明補充α-酮戊二酸（α-KG，TET酶的輔因子），可以逆轉1-NP誘導的中間神經元遷移相關基因特定位點的低羥甲基化，緩解中間神經元遷移延遲并改善由1-NP引起的自閉癥。

標題：Prenatal 1-Nitropyrene Exposure Causes Autism-Like Behavior Partially by Altering DNA Hydroxymethylation in Developing Brain（產前1-硝基芘暴露通過腦發育過程中DNA羥甲基化變化誘導子代自閉癥樣行為）

期刊：Advanced Science

影響因子：IF 14.3 / Q1

技術平臺：ACE-seq、RNA-seq、行為評估、細胞功能分析等

研究摘要：

本研究旨在研究產前暴露于1-硝基芘（1-NP）對小鼠模型中自閉癥樣行為的影響。三室社交互動測試結果表明，產前1-NP暴露在斷奶期間引起自閉癥樣行為。膜片鉗技術顯示，在1-NP暴露的斷奶幼崽內側前額葉皮層中的抑制性突觸傳遞減少。免疫熒光顯示，產前1-NP暴露減少了胎兒和斷奶幼崽前額葉中谷氨酸脫羧酶67（GAD67）陽性的中間神經元數量。此外，產前1-NP暴露導致GAD67陽性中間神經元遷移延遲，并下調胎兒前腦與中間神經元遷移相關的基因，如Nrg1、Erbb4和Sema3F。從機制上講，產前1-NP暴露通過抑制胎兒前腦中的TET活性，以誘導中間神經元遷移相關基因的羥甲基化降低。補充α-KG（TET酶輔因子）可以逆轉1-NP誘導的中間神經元遷移相關基因特定位點的低羥甲基化。實驗結果表明，α-KG補充劑緩解了胎兒前腦中1-NP誘導的中間神經元遷移延遲；母體α-KG補充劑改善了斷奶子代中1-NP誘導的自閉癥樣行為。總之，產前1-NP暴露可以通過發育中大腦中間神經元遷移相關基因的DNA羥甲基化變化，而引起自閉癥樣行為。

實驗設計：

30只懷孕小鼠隨機分為3組，分別給予不同劑量的1-NP（0、10、100μg/kg）；后續實驗懷孕小鼠分為不同的處理組：對照組、1-NP暴露組、α-KG補充組以及1-NP+α-KG聯合組。產前在指定時間點收集胎兒前腦樣本；產后在指定時間點收集子代前額葉皮質(mPFC)樣本。用于后續的行為評估、DNA羥甲基化檢測（ACE-seq）、TET酶活性檢測、α-KG水平檢測、RNA測序（RNA-seq）與RT-PCR驗證、細胞功能分析等實驗。

圖1：動物和處理的實驗方案

結果圖形：

（1）母體 1-NP 暴露對子代自閉癥樣行為的影響

圖2：母體1-NP暴露對斷奶子代自閉癥樣行為的影響。30只懷孕小鼠從妊娠第0天（GD0）到第17天（GD17）每天口服接受不同劑量的1-NP（0,10, 100 μg/kg）。所有懷孕的小鼠都自然分娩。 A–F) 使用三室社交互動測試來評估斷奶子代（PND28）的自閉癥樣行為。 G–L) 使用三室社交互動測試來評估成年子代（PND70）的自閉癥樣行為。

（2）母體1-NP暴露對子代mPFC中微小抑制性后神經突觸電流（miniature inhibitory?postsynaptic current，mIPSC）的影響

圖3：母體1-NP暴露對子代mIPSC的影響。 A–F) 對斷奶子代（PND28）的興奮性神經元進行膜片鉗實驗，以檢測前額葉皮層（mPFC）中的微小抑制性突觸后電流（mIPSC）。 G–L) 對成年子代（PND70）的興奮性神經元進行膜片鉗實驗，以測量mPFC中的mIPSC。每組樣本量（N）為3只小鼠的12個興奮性神經元。

（3）孕期母體1-NP暴露對斷奶子代mPFC中GAD67+中間神經元的影響

圖4：母體1-NP暴露對斷奶子代GAD67中間神經元的影響。 A–G) 雄性子代在PND28被安樂死，并且采集其前額葉皮層（mPFC）。 A-B.?? Western blot檢測GAD67。 C-D.? ?Western blot檢測NeuN。 E.? ?免疫熒光（IF）分析mPFC各個亞區的GAD67+和NeuN+神經元。 F.? ??mPFC各個亞區中GAD67+與NeuN+神經元的比例。 G.? ?mPFC各個亞區中NeuN+神經元的百分比。 H–N) 雌性子代在PND28被安樂死，并且收集其mPFC。 H-I. ?Western blot檢測GAD67。 J-K. ?Western blot檢測NeuN。 L.? ?免疫熒光分析mPFC各個亞區的GAD67+和NeuN+神經元。 M.?? mPFC各個亞區中GAD67+與NeuN+神經元的比例。 N.? ?mPFC各個亞區中NeuN+神經元的百分比。 Cg1：cingulate cortex, area 1；PrL：prelimbic cortex；IL：infralimbic cortex。

（4）妊娠期1-NP暴露對胎兒前腦中間神經元遷移的影響

圖5：妊娠期1-NP暴露對胎兒大腦中間神經元遷移的影響

（5）妊娠期1-NP暴露對胎兒前腦神經元遷移相關基因羥甲基化的影響

在妊娠期第14天（GD14）的胎兒前腦中，分析了妊娠期1-NP暴露對中間神經元遷移相關基因中5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）含量的影響。Nrg1、Erbb4和Sema3F基因的甲基化位點序列（圖6A），盡管Nrg1和Erbb4基因中富含CpG片段的5hmC水平在兩組間沒有差異，但在1-NP暴露的胎兒中，Sema3F基因的一個富集CpG片段的5hmC水平有所降低（圖6B）。隨后檢測了Nrg1、Erbb4和Sema3F基因CpG位點的5hmC含量（圖6C），在1-NP組胎兒前腦中，Nrg1基因的CpG位點（chr1:32009246）的5hmC含量減少。在1-NP組胎兒前腦中，Erbb4基因的兩個CpG位點（chr8: 69107743和69107866）的5hmC含量減少。而在1-NP組胎兒中，Sema3F基因的三個CpG位點（chr9: 107709269、107709348和107710238）的5hmC水平降低。在胎兒前腦中分析了三種DNA去甲基化酶TET1、TET2和TET3的活性。盡管1-NP并未影響TET1、TET2和TET3的表達（圖6D–F），但在1-NP組胎兒的前腦中，TETs酶的活性降低（圖6G）。

圖6：妊娠1-NP暴露對胎兒前腦中間神經元遷移相關基因羥甲基化的影響。

（6）妊娠期1-NP暴露對胎兒前腦線粒體功能的影響

為研究1-NP暴露導致胎兒前腦中與中間神經元遷移相關基因的羥甲基化變化以及抑制TET酶活性的原因，研究對妊娠第14天（GD14）的胎兒前腦進行轉錄組分析。KEGG和GO分析發現，1-NP導致前腦的線粒體相關代謝功能出現障礙，例如煙酸/煙酰胺代謝、類固醇生物合成和長鏈脂肪酸代謝（圖7A、B）。基于KEGG的基因集富集分析（GSEA）顯示，在1-NP暴露的胎兒前腦中，氧化磷酸化通路呈負向富集（圖7C）。基于GO的GSEA顯示，在1-NP暴露的胎兒前腦中線粒體電子傳遞鏈和氧化磷酸化通路呈負向富集（圖7D,E）。基于Reactome的GSEA顯示，三羧酸（TCA）循環和呼吸電子傳遞在1-NP暴露的胎兒前腦中呈負向富集（圖7F）。盡管線粒體面積沒有差異，但在1-NP暴露的胎兒前腦中，中間神經元起源地神經節隆起的線粒體嵴結構消失（圖7G–I）。琥珀酸脫氫酶（SDH）B和vATP5A（兩種與氧化磷酸化相關的蛋白）在1-NP誘導的胎兒前腦中下調（圖7J–L）。最后線粒體α-酮戊二酸（α-KG）合成的關鍵酶IDH2和TET酶的輔因子α-KG，在1-NP組的胎兒前腦中減少（圖7M–O）。

圖7：妊娠期1-NP暴露對胎兒前腦線粒體功能的影響。

（7）補充α-KG對胎兒前腦中1-NP誘發的神經元遷移相關基因低羥甲基化的影響

補充α-KG對1-NP引起的中間神經元遷移相關基因低羥甲基化的影響（圖8A-F）。正如預期，妊娠期間補充α-KG抑制了1-NP引起的Nrg1基因中CpG位點（chr1: 32009246）的5hmC減少（圖8A）。此外，妊娠期間補充α-KG預防了1-NP引起的Sema3F基因一個CpG位點（chr9:107710238）的5hmC減少（圖8F）。補充α-KG可以保護1-NP誘導的Erbb4或其他Sema3F基因CpG位點的5hmC減少趨勢（圖8B–E）。分析α-KG對1-NP引起的中間神經元遷移相關基因表達減少的影響（圖8G–I），結果表明，妊娠期間補充α-KG緩解了1-NP在胎兒前腦中引起的Sema3F、Nrg1和Erbb4減少（圖8G–I）。α-KG補充對1-NP引起的神經元間遷移抑制的影響（圖8J、K）結果表明，妊娠期補充 α-KG 逆轉了 1-NP 導致前腦皮層中端和遠端 GAD67 中間神經元減少。

圖8：補充α-KG對1-NP誘發的胎兒前腦中間神經元遷移相關基因的低羥基甲基化和中間神經元遷移抑制的影響 ?

（8）補充α-KG對1-NP誘導的中間神經元遷移抑制的影響

圖9：妊娠期補充??-KG對斷奶子代中間神經元的影響

（9）補充α-KG對1-NP誘導的子代mIPSC傳遞障礙和自閉癥樣行為的影響

圖10：妊娠期補充??-KG對1-NP誘導mIPSC傳遞障礙和自閉癥樣行為的影響

易小結

本研究利用小鼠模型進行實驗，將懷孕小鼠分為不同劑量的1-NP暴露組。通過三室測試評估幼崽的ASD樣行為；使用膜片鉗技術檢測小鼠大腦前額葉皮層的抑制性突觸傳遞；通過免疫熒光技術檢測特定腦區的神經元數量和遷移；利用ACE-seq和RNA-seq檢測與神經元遷移相關的基因表達和DNA羥甲基化水平；最后通過補充α-酮戊二酸（??-KG）來研究其對1-NP誘導的效應的逆轉作用。

研究結果揭示了產前1-NP暴露導致斷奶期小鼠出現ASD樣行為。1-NP暴露減少了小鼠大腦前額葉皮層中抑制性突觸傳遞；減少了胎兒和斷奶幼崽前額葉中的谷氨酸脫羧酶67（GAD67）陽性神經元數量；延緩了GAD67陽性神經元的遷移，并下調了與神經元遷移相關的基因表達；通過抑制TET酶活性降低了特定基因的羥甲基化水平。補充??-KG能夠逆轉1-NP誘導的羥甲基化降低，并改善神經元遷移延遲。母體補充??-KG能夠改善1-NP誘導的幼崽ASD樣行為。

總之，本研究結果表明，產前1-NP暴露通過改變發育中大腦內神經元遷移相關基因的DNA羥甲基化，部分導致了ASD樣行為。??-KG補充可能是一種用于減輕環境毒素引起的神經發育障礙的潛在干預措施。本研究提供了關于環境污染物如何可能影響神經發育和行為的新見解，并為預防和治療相關的神經發育障礙提供了可能的策略。

參考文獻：

Zhao T, Huang CQ, Zhang YH, Zhu YY, ChenXX, Wang T, Shao J, Meng XH, Huang Y, Wang H, Wang HL, Wang B, Xu DX. Prenatal1-Nitropyrene Exposure Causes Autism-Like Behavior Partially by Altering DNAHydroxymethylation in Developing Brain. Adv Sci (Weinh). 2024 May 16:e2306294.doi: 10.1002/advs.202306294. PubMed PMID: 38757379.