SNP芯片的原理

1. Illumina的SNP芯片原理

   Illumina的SNP生物芯片的優(yōu)勢(shì)在于：

   第1，它的檢測(cè)通量很大，一次可以檢測(cè)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)

   第2，它的檢測(cè)準(zhǔn)確性很高，它的準(zhǔn)確性可以達(dá)到99.9%以上

   第3，它的檢測(cè)的費(fèi)用相對(duì)低廉，大約一個(gè)90萬(wàn)位點(diǎn)的芯片（每個(gè)樣本的）檢測(cè)費(fèi)用在一、兩千人民幣

   Illumina的生物芯片系統(tǒng)，主要是由：芯片、掃描儀、和分析軟件組成。

   Illumina的生物芯片，由2部分組成：第1是玻璃基片，第2是微珠。

   image

   這個(gè)玻璃基片，它的大小和一張普通的載玻片差不多大小，它起到的作用，就是給微珠做容器。

   在這個(gè)玻璃基片上，通過(guò)光蝕刻的方法，蝕刻出許多個(gè)排列整齊的小孔。每個(gè)小孔的尺寸都在微米級(jí)，這些小孔是未來(lái)容納微珠的地方。小孔的大小與微珠正好相匹配，一個(gè)小孔正好容納一個(gè)微珠。

   微珠是芯片的核心部分，微珠的體積很小，只有微米級(jí)。

   每個(gè)微珠的表面，都各偶聯(lián)了一種序列的DNA片段。每個(gè)微珠上，有幾十萬(wàn)個(gè)片段，而一個(gè)珠子上的片段，都是同一種序列。

   這些DNA片段的長(zhǎng)度是73個(gè)堿基，而這73個(gè)堿基又分成2個(gè)功能區(qū)域。

   image

   靠近珠子的這一端的23個(gè)堿基的序列，被稱為Address序列，它也是DNA片段的5'端。它是標(biāo)識(shí)微珠的標(biāo)簽序列。標(biāo)簽序列，通過(guò)堿基的排列組合，得到許多可能，每種序列，就是相應(yīng)微珠的身份證號(hào)碼（ID號(hào)）。

   DNA片段上離珠子遠(yuǎn)的那一端的50個(gè)堿基，也就是3'端的序列，被稱作Probe序列，它的作用，是與目標(biāo)DNA進(jìn)行互補(bǔ)雜交。

   一種Address序列，就對(duì)應(yīng)了一種probe序列。它們之間有著一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系。

   image

   在Illumina生產(chǎn)芯片的過(guò)程當(dāng)中，是把要做芯片的幾十萬(wàn)種微珠，按設(shè)定的比例進(jìn)行混合好，撒到玻璃基片上。微珠隨機(jī)地落入基片的小孔當(dāng)中，然后，通過(guò)檢測(cè)芯片上每個(gè)小孔當(dāng)中的微珠上的Address序列，就可以知道，這個(gè)小孔當(dāng)中是哪種微珠。

2. 又因?yàn)锳ddress序列和Probe序列有著一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，這樣，也就知道了每個(gè)小孔當(dāng)中，有哪種Probe。反過(guò)來(lái)說(shuō)，也就知道了每種Probe分布在哪幾個(gè)小孔中了。

   所以，Illumina公司出廠的每一張芯片，都要跟一個(gè)“.dmap”文件。這個(gè).dmap文件，標(biāo)注了每一張芯片上，每一個(gè)微孔當(dāng)中，分別是哪種微珠。

   用戶做完芯片實(shí)驗(yàn)，得到掃描數(shù)據(jù)后，要從Illumina的網(wǎng)站上下載這張芯片的對(duì)應(yīng)dmap文件，然后才能解讀這張芯片。

   在一張芯片的一個(gè)反應(yīng)（樣本位）當(dāng)中，每種珠子平均有約15顆或更多。

   說(shuō)完了Address序列的功能，接著我們來(lái)說(shuō)Probe序列的功能。

   Illumina的生物芯片掃描儀，是掃描2種（熒光）顏色的：紅色和綠色。而堿基有4種：A、C、G、T，要用2種熒光顏色，在一次實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，就區(qū)分出四種堿基，就需要一些巧妙的設(shè)計(jì)。

   在Illumina的SNP芯片Probe設(shè)計(jì)上，先把要檢測(cè)的位點(diǎn)，分成2種情況。

   第一種情況是比較簡(jiǎn)單的，我們先舉例來(lái)說(shuō)明。如果一個(gè)SNP位點(diǎn)的野生型是“G”，突變型是“A”，那么就設(shè)計(jì)一個(gè)探針。這個(gè)探針的3'端的最末一個(gè)堿基，就挨著這個(gè)SNP位點(diǎn)。在

   實(shí)驗(yàn)過(guò)程當(dāng)中，目標(biāo)片段通過(guò)互補(bǔ)雜交，結(jié)合到這個(gè)探針上，然后，加入四種帶標(biāo)記的雙脫氧核苷酸。其中A、T兩種核苷酸是用DNP（二硝基苯）來(lái)進(jìn)行標(biāo)記的。C、G兩種堿基是用生物素來(lái)標(biāo)記的。同時(shí)，加入聚合酶，聚合酶就會(huì)在探針的3’末端，加上一個(gè)雙脫氧核苷酸，并同時(shí)捎帶連上一個(gè)標(biāo)記物。

   
   
   image
   image

   接著加入綠色熒光標(biāo)記的鏈霉親合素，紅色熒光標(biāo)記的抗DNP的抗體。綠色熒光標(biāo)記的鏈霉親合素與生物素特異地結(jié)合，讓帶生物素的C、G堿基顯出綠色。紅色熒光標(biāo)記的抗DNP的抗體與DNP結(jié)合，讓帶DNP的A、T堿基顯出紅色。

   image

   image

   并且進(jìn)一步加入生物素標(biāo)記的抗鏈霉親合素的抗體、和DNP標(biāo)記的，抗異種抗體FC端的抗體。加入這兩種抗體的作用，是使熒光信號(hào)得到進(jìn)一步的級(jí)聯(lián)放大。

   抗體結(jié)合完了之后，經(jīng)過(guò)清洗，把游離的抗體都給洗掉。在掃描儀下進(jìn)行掃描。

   如果發(fā)出的光是綠光，就說(shuō)明這個(gè)SNP結(jié)合的位點(diǎn)，是個(gè)“G”堿基的純合子。如果發(fā)出的是紅光，就說(shuō)明這個(gè)SNP位點(diǎn)是個(gè)“A”堿基的純合子。如果既有紅光、又有綠光，而且兩種顏色的光的光強(qiáng)差不多，就說(shuō)明這個(gè)SNP位點(diǎn)是一個(gè)“A”和“G”的雜合子。

   說(shuō)明了上面的道理，那么，A-C、A-G、T-C、T-G，這四種SNP情況都可以理解了。因?yàn)樗鼈冮L(zhǎng)出來(lái)的堿基，最后都會(huì)被染成不同的顏色，所以，可以被輕松地區(qū)分。

   image

   那么，接下來(lái)，你就會(huì)想，對(duì)于A：T，或者C：G型的SNP位點(diǎn)，該如何來(lái)區(qū)分。因?yàn)椤癆：T”會(huì)有同樣的紅色熒光，“C：G”也會(huì)有同樣的綠色熒光。

   好，接著我們就來(lái)說(shuō)，這第二種情況的SNP位點(diǎn)的區(qū)分方案。

   剛才我們說(shuō)了，第一種SNP位點(diǎn)的區(qū)分方案，是把探針設(shè)計(jì)到緊挨著SNP位點(diǎn)，但留出SNP位點(diǎn)，讓下一個(gè)延長(zhǎng)的堿基，按照互補(bǔ)原則，根據(jù)SNP位點(diǎn)的堿基來(lái)生長(zhǎng)。

   那么，這第二種情況的SNP，在設(shè)計(jì)探針的時(shí)候，最后一個(gè)堿基，是蓋在SNP位點(diǎn)上的。而且是設(shè)計(jì)2種探針，如果SNP位點(diǎn)是“A”和“T”，那么探針也設(shè)計(jì)“A”和“T”。并且分別蓋在SNP位點(diǎn)上面。

   這2種探針，在與目標(biāo)DNA片段結(jié)合的時(shí)候，如果最后一個(gè)堿基是互補(bǔ)的，那么接下來(lái)的延伸反應(yīng)就會(huì)發(fā)生，新的帶標(biāo)簽的雙脫氧核苷酸就會(huì)被加到探針鏈上。再接下來(lái)，就會(huì)被熒光抗體染色，在激光掃描的過(guò)程當(dāng)中，就會(huì)發(fā)光。

   反之，如果最后一個(gè)堿基是不互補(bǔ)的，那么接下來(lái)的延伸反應(yīng)，就不會(huì)發(fā)生。當(dāng)然，也就不會(huì)有標(biāo)簽加到探針鏈上，再接下來(lái)，熒光抗體也就不會(huì)將之染色。在后面的激光掃描當(dāng)中，就不會(huì)發(fā)光。

   
   
   image

   激光掃描的結(jié)果，如果末尾是A堿基的探針發(fā)光，而末尾是T堿基的探針不發(fā)光，那么說(shuō)明目標(biāo)SNP位點(diǎn)上是一個(gè)“T”的純合子；反之，則是“A”的純合子；如果A和T的探針都發(fā)光，而且發(fā)光強(qiáng)度差不多，那說(shuō)明SNP位點(diǎn)上是一個(gè)“A”和“T”的雜合子。

   理解了Illumina的SNP芯片的工作原理，也就理解了它為什么準(zhǔn)確率比較高。因?yàn)樗峭ㄟ^(guò)“紅”或“綠”，和“有”或“無(wú)”，來(lái)區(qū)分一個(gè)SNP位點(diǎn)到底是哪種堿基的。

   2. Affymetrix芯片原理

   今天，會(huì)和大家談一下 Affymetrix 公司的生物芯片.

   Affymetrix 公司是著名的生物芯片公司,它的芯片當(dāng)中包含了：RNA表達(dá)量分析（表達(dá)譜芯片）、SNP檢測(cè)（基因分型）、拷貝數(shù)變異（Copy Number Variation，CNV）、small RNA、甲基化等多種芯片。

   今天我們會(huì)和大家介紹，它應(yīng)用得最廣的兩種芯片：表達(dá)譜芯片、和SNP分型芯片。

   首先，我們介紹一下 Affymetrix 的（生物芯片的）儀器，目前在售的儀器，主要有4個(gè)機(jī)型，從小到大，分別是：

   1. GeneAtlas

   2. GeneChipScanner 3000 7G（簡(jiǎn)稱：7G）

   3. GeneChipSystem 3000 DX2（簡(jiǎn)稱：DX2）

   4. GeneTitan

   GeneAtlas 是一個(gè)小型系統(tǒng)，它主要可以掃描4張芯片一組的小芯片條。它的特點(diǎn)是：經(jīng)濟(jì)、易用。

   GeneChip Scanner 3000 7G（7G）和GeneChipSystem 3000 DX2（DX2）。是一款機(jī)器的2個(gè)版本，其中，“7G”版是科研型版本、 “DX2”是臨床版本。其中，DX2已經(jīng)取得了美國(guó)FDA和中國(guó)CFDA的認(rèn)證。

   GeneTitan 是新機(jī)型，它的通量更大，自動(dòng)化程度更高。平均到每個(gè)樣本的檢測(cè)成本更低。

   GeneTitan在生物樣本庫(kù)項(xiàng)目（BioBank）當(dāng)中，應(yīng)用很多介紹完儀器，接下來(lái)，我們來(lái)介紹Affymetrix 芯片的制造過(guò)程。

   制造原理

   Affymetrix 芯片的制造過(guò)程，類似半導(dǎo)體芯片的制造過(guò)程。是通過(guò)光蝕刻來(lái)完成的。

   image
   image
   image

   它（生物芯片）的基片，是一張大的玻璃片，稱為：“Wafer”。

   首先，在玻璃基片上加上保護(hù)基團(tuán)，也就是玻璃板上的這些藍(lán)色小帽子。這些保護(hù)基團(tuán)，它可以阻止接下來(lái)的DNA的延長(zhǎng)反應(yīng)。同時(shí)，這些保護(hù)基團(tuán)是對(duì)光敏感的。

   一旦受到紫外光的照射，這些保護(hù)基團(tuán)就會(huì)從所連著的羥基上掉下來(lái)。把羥基給暴露出來(lái)。

   接下來(lái)，進(jìn)行光刻。我們以玻璃基片上3*2的6個(gè)小格子，這樣一個(gè)小區(qū)域來(lái)說(shuō)明光刻的過(guò)程。

   先用一個(gè)光罩（mask 1）來(lái)遮住一部分的玻璃板區(qū)域，在光罩上，是一系列排列整齊的小方格。

   有些小方格是透明的，還有一些小方格是不透明的，可以擋住光。

   
   
   image
   image
   image
   image

   紫外光透過(guò)光罩（Mask 1），照到玻璃基片上。這些透明的格子所對(duì)應(yīng)的地方，保護(hù)基團(tuán)被紫外光照射到。

   光敏的保護(hù)基團(tuán)就從原來(lái)所連的羥基上掉下來(lái)，而那些不透明格子所對(duì)應(yīng)的地方，因?yàn)闆](méi)有被光照到，保護(hù)基團(tuán)依然連接在原來(lái)的羥基上。

   接下來(lái)，把要連的堿基底物加到玻璃基片上，這里第一個(gè)要加的堿基是“A”堿基，玻璃基片上剛才被光照射過(guò)的，去掉了保護(hù)基團(tuán)的地方。

   就會(huì)與新的A堿基結(jié)合，這樣，A堿基就連接到玻璃基片上。

   而剛才被光罩上不透明的區(qū)域所覆蓋的，還留有保護(hù)基團(tuán)的地方，就不會(huì)與新加入的“A”堿基進(jìn)行結(jié)合。

   請(qǐng)注意，這里新加進(jìn)來(lái)的A堿基，也帶著一個(gè)保護(hù)基團(tuán)。

   接著，進(jìn)行第2輪的光刻，也就是拿第二張光罩蓋Mask 2，蓋在玻璃基片上。

   紫外光再次透過(guò)光罩，照到玻璃基片上。但是請(qǐng)注意，這第二張光罩上的透明與不透明格子的分布。

   是與第一張光罩不一樣的，在第二次光照射之后，玻璃基片上對(duì)于應(yīng)于第二個(gè)光罩透明的部分，上面的保護(hù)基團(tuán)就掉了。

   然后，我們把第二輪要種的T堿基鋪到玻璃基片上，玻璃基片上，那些在第二輪光照射當(dāng)中，去掉了保護(hù)基團(tuán)的位置，就會(huì)長(zhǎng)出一個(gè)T堿基。

   再接著，用Mask 3進(jìn)行遮蓋，進(jìn)行第3輪的光照射，然后，加上C堿基。

   這樣，不斷地重復(fù)這個(gè)過(guò)程，玻璃基片上不同的位置，就會(huì)按原來(lái)的設(shè)計(jì)意圖，長(zhǎng)出我們想要的DNA鏈來(lái)。

   
   
   image

   這些DNA鏈，就是探針，這些探針，會(huì)在后面的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，與目標(biāo)DNA鏈或者RNA鏈，進(jìn)行雜交、結(jié)合。

   Affymetrix 公司芯片上的的探針，都是3’端連到玻璃基片上的。

   Affymetrix 的芯片當(dāng)中，做表達(dá)譜的芯片，也就是測(cè)RNA表達(dá)量的芯片，探針的長(zhǎng)度是25個(gè)堿基，而做SNP分型的芯片，探針的長(zhǎng)度是30個(gè)堿基。

   Affymetrix 芯片上，長(zhǎng)有相同序列DNA鏈的一個(gè)小點(diǎn)，被稱為一個(gè)“Feature”。這也就是未來(lái)芯片掃描圖上的一個(gè)光點(diǎn)，一張芯片上最多可以有680萬(wàn)個(gè)Feature。

   image
   image
   image

   每個(gè)Feature上會(huì)有幾百萬(wàn)條相同序列的DNA探針。

   這樣一張大的玻璃基片，在種好所有的DNA鏈之后，就被裁切成一小片一小片的玻璃片，每張小玻璃片上都有一套完整的探針。每一張小的玻璃片，加上了輔助液流的外殼，再打上相應(yīng)的標(biāo)識(shí)，就成了一張生物芯片。

   Affymetrix 公司的芯片，它所有設(shè)計(jì)的探針，都在確定的位置。在最后的芯片判讀過(guò)程當(dāng)中，

   也是通過(guò)光點(diǎn)的空間位置，來(lái)知道測(cè)到的是哪個(gè)探針。

   RNA芯片實(shí)驗(yàn)原理

   接下來(lái)，我們介紹芯片的實(shí)驗(yàn)原理。我們先來(lái)說(shuō)，表達(dá)譜的實(shí)驗(yàn)原理。

   Affymetrix 的表達(dá)芯片，分成傳統(tǒng)的In Vitro Transcription 芯片，也就是 IVT 芯片（In Vitro Transcription 的縮寫），和新一代的 Whole Transcriptome 芯片，也就是 WT 芯片 （Whole Transcriptome 的縮寫）。

   其中 IVT 芯片是用 Oligo dT 引物和T7 逆轉(zhuǎn)錄酶來(lái)得到 cDNA 鏈的，所以，它得到的cDNA主要是靠近mRNA 3’位末端的cDNA。相應(yīng)地，它的探針也主要針對(duì)每個(gè)基因的最后一、二個(gè)外顯子來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)。

   
   
   image
   image

   比較著名IVT類的芯片，有經(jīng)典的 U133芯片，和較為經(jīng)濟(jì)的 PrimeView 芯片。

   而 WT 芯片是用隨機(jī)引物和 T7 逆轉(zhuǎn)錄酶來(lái)得到 cDNA 的，所以，它得到的 cDNA 會(huì)覆蓋轉(zhuǎn)錄本上更多的區(qū)域，相應(yīng)地，它的探針也是針對(duì)基因的整個(gè)轉(zhuǎn)錄本來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)的。

   WT芯片的好處：

   一、是它可以覆蓋轉(zhuǎn)錄本上更多的區(qū)域，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的代表性就會(huì)更強(qiáng)。

   二、是它可以針對(duì)因?yàn)椴町惣艚铀纬傻牟煌D(zhuǎn)錄本，分別設(shè)計(jì)探針，這樣，就可以知道不同的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量的變化了。

   三、是它可以檢測(cè)到長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long Non-CodingRNA, LncRNA)

   比較著名的WT芯片有 HTA 2.0、Exon 1.0、Gene 2.0/2.1 等。

   實(shí)驗(yàn)過(guò)程當(dāng)中，先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到第一鏈的cDNA，緊接著就合成第二鏈的cDNA，變成雙鏈cDNA之后，這個(gè)雙鏈cDNA就可以作為接下來(lái)轉(zhuǎn)錄的模板了。

   
   
   image
   image

   接下來(lái)，用摻有生物素標(biāo)記的UTP的聚合反應(yīng)底物，也就是ATP、CTP、TTP，再加上生物素標(biāo)記的UTP，形成的4個(gè)單核苷酸的混合物，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄得到cRNA (comple-mentaryRNA)。

   因?yàn)檗D(zhuǎn)錄的原料中含有被生物素標(biāo)記的UTP，所以轉(zhuǎn)錄出來(lái)的cRNA片段就是帶有生物素標(biāo)簽。

   然后拿這些cRNA片段與芯片進(jìn)行雜交，cRNA與芯片上的探針，依照堿基互補(bǔ)的原則進(jìn)行雜交，雜交完了之后，用標(biāo)記了藻紅蛋白的鏈霉親合素，也就是SAPE，對(duì)芯片進(jìn)行染色（streptavidin-phycoerythrin ，SAPE）。

   這其中，（SAPE上的）鏈霉親合素會(huì)與cRNA上的生物素進(jìn)行特異地結(jié)合；而（SAPE上的）藻紅蛋白在激發(fā)光的照射下，可以發(fā)出紅色熒光。

   
   
   image
   image

   然后，再加入標(biāo)記了生物素的抗鏈霉親合素抗體，抗體就親合吸附到那些已經(jīng)吸附在cRNA上的鏈霉親合素上。

   親合吸附完成之后，再加入SAPE。對(duì)芯片進(jìn)行二次染色。

   SAPE就吸附到抗體上的那些生物素上，通過(guò)上述的再次染色，可以把更多的藻紅蛋白吸附到目標(biāo)cRNA片段上，以增加熒光的強(qiáng)度。

   化學(xué)反應(yīng)完成之后，就可以把芯片拿到掃描儀上進(jìn)行激光掃描了。

   激光掃描之后，得到一張有著密密麻麻光點(diǎn)的圖片，這張圖片也就是熒光信號(hào)的矩陣，光點(diǎn)的X、Y軸的位置，也就是探針的ID號(hào)。

   光點(diǎn)的（光）強(qiáng)度，也就對(duì)應(yīng)著被雜交到的cRNA的量，而這個(gè)cRNA的量，就反映了對(duì)應(yīng)基因特定mRNA轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量。

   
   
   image

   SNP分型芯片實(shí)驗(yàn)原理

   說(shuō)完了表達(dá)譜芯片，我們接下來(lái)說(shuō)基因分型芯片，也就是SNP分型芯片。

   Affymetrix 公司的SNP分型芯片有兩種實(shí)驗(yàn)原理：新的是Axiom芯片，是基于連接反應(yīng)的；而老的卡式芯片，是基于目標(biāo)DNA片段與探針序列進(jìn)行雜交。看序列是否完全配對(duì)。

   我們先來(lái)說(shuō)新的Axiom方法，Axiom方法中，有兩種探針在起作用。

   
   
   image
   image

   第一種探針是芯片上的捕獲探針，它是30個(gè)堿基的長(zhǎng)度。它起到的作用是把目標(biāo)DNA片段，固定到芯片表面。

   第二種探針是顯色探針，它負(fù)責(zé)對(duì)SNP芯片進(jìn)行顯色。

   我們先來(lái)看顯色探針的設(shè)計(jì)，顯示探針共分成四組，A、C、G、T各一組探針。它們都是9個(gè)堿基的長(zhǎng)度，它們的3’末端的第一個(gè)堿基是特異的，而從第二個(gè)堿基到第9個(gè)堿基都是簡(jiǎn)并的。

   這其中，3’端是C、或者G的，設(shè)計(jì)成5’端帶一個(gè)生物素標(biāo)簽。也就是最后會(huì)被染成紅色熒光。

   而3’端是A、或者T的，5’端被設(shè)計(jì)成帶另外一種標(biāo)簽，最后會(huì)被染色綠色熒光。

   接下來(lái)，我們以一個(gè)“G:T”型的SNP位點(diǎn)為例，來(lái)進(jìn)行說(shuō)明。

   在設(shè)計(jì)這個(gè)SNP位點(diǎn)的探針的時(shí)候，所設(shè)計(jì)的捕獲探針，是正好到SNP位點(diǎn)旁邊的一個(gè)堿基。

   實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行兩輪雜交。

   第一輪雜交，是目標(biāo)DNA與芯片進(jìn)行雜交，結(jié)果是芯片上的捕獲探針會(huì)抓到相匹配的目標(biāo)DNA片段，接著加入顯色探針，進(jìn)行第二輪雜交。

   這一輪雜交，把顯色探針，雜交到目標(biāo)DNA片段上。

   然后用連接酶進(jìn)行連接，因?yàn)檫B接酶會(huì)對(duì)連接位點(diǎn)的前后幾個(gè)堿基進(jìn)行識(shí)別。

   只有前后幾個(gè)堿基都完全匹配，連接反應(yīng)才會(huì)發(fā)生。

   所以，利用連接酶的這種識(shí)別作用，讓只有與目標(biāo)DNA片段互補(bǔ)的顯色探針，才會(huì)被連接酶連接到捕獲探針上去。連接反應(yīng)完成之后，把游離的顯色探針都給洗掉。

   再用帶熒光標(biāo)記的染色試劑進(jìn)行染色，剛才連到捕獲探針上的生物素標(biāo)簽，就在這個(gè)染色過(guò)程中被染上紅色熒光（染料）。

   反之，如果目標(biāo)DNA片段上，這個(gè)位點(diǎn)是個(gè)“T”堿基，相應(yīng)地，它的標(biāo)簽基團(tuán)就會(huì)被染上綠色熒光基團(tuán)。

   
   
   image

   染色完成之后，就可以用在激光掃描下對(duì)芯片進(jìn)行掃描了，掃描過(guò)程當(dāng)中，如果看到這個(gè)探針上所發(fā)出的光是單純的紅色，就可以判斷這個(gè)位點(diǎn)的SNP型是“G”型純合子。如果發(fā)出的熒光是單純的綠光，那么就可以判斷這個(gè)SNP位點(diǎn)是個(gè)“T”型純合子，如果發(fā)出的光，既有紅光，又有綠光；而且紅光、和綠光的光強(qiáng)差不多，則可以判斷這個(gè)SNP位點(diǎn)是個(gè)“G”和“T”的雜合子。

   同樣的道理，對(duì)于A：C、 A：G、 T：C、 T：G，這4種SNP情況，因?yàn)椴煌幕蛐蜁?huì)發(fā)出不同顏色的熒光，所以只要看熒光的顏色、和熒光的光強(qiáng)，就可以分辨SNP型了。

   那么對(duì)于"A:T"或者"C:G"型的SNP位點(diǎn)，就需要用不同的檢測(cè)方案，因?yàn)?A / T 探針都是綠色熒光，而 C / G 探針都是紅色熒光。

   Affymetrix 對(duì)這2種SNP型，另外設(shè)計(jì)了相應(yīng)的檢測(cè)方案。我們拿“ A:T” 型的SNP來(lái)說(shuō)明。

   它針對(duì)“A”設(shè)計(jì)一個(gè)探針，再對(duì)“T”。設(shè)計(jì)一個(gè)探針。而這里設(shè)計(jì)的探針，它是蓋到SNP位點(diǎn)上的。

   請(qǐng)注意，這與之前第一種情況所設(shè)計(jì)的探針（顏色差異探針）不同，之前的探針是設(shè)計(jì)到SNP位點(diǎn)的旁邊，而不是蓋到SNP位點(diǎn)上。

   這里，我們以一個(gè)5’端最后一個(gè)堿基為“A”的捕獲探針為例，來(lái)看它上面所發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)。在經(jīng)過(guò)第一輪的捕獲雜交后，目標(biāo)DNA片段與之發(fā)生雜交。

   如果目標(biāo)DNA片段的SNP位置上是一個(gè)“T”堿基，那么捕獲探針與目標(biāo)DNA片段完美匹配，接下來(lái)經(jīng)過(guò)第二輪的雜交，一個(gè)顯色探針雜交到它的旁邊。

   
   
   image
   image

   再經(jīng)過(guò)連接反應(yīng)，顯色探針上的標(biāo)簽就連到了這個(gè)捕獲探針上。反之，如果目標(biāo)DNA片段上這個(gè)SNP位置上是一個(gè)“A”，那么它與捕獲探針上的“A”是不匹配的。

   那么在第二輪的雜交過(guò)程當(dāng)中，雖然會(huì)有顯色探針會(huì)停在它的旁邊，但是，連接反應(yīng)過(guò)程當(dāng)中，因?yàn)檫B接酶要求嚴(yán)格的堿基匹配，所以連接反應(yīng)不會(huì)發(fā)生。

   停在它旁邊的顯色探針因?yàn)椴荒芄矁r(jià)地連到捕獲探針上。所以在接下來(lái)的洗脫過(guò)程當(dāng)中，就會(huì)被洗掉。

   這樣，在激光掃描過(guò)程當(dāng)中，如果這個(gè)探針上發(fā)出熒光，則說(shuō)明對(duì)應(yīng)的SNP位點(diǎn)上有“T”堿基。如果這個(gè)探針上不發(fā)出熒光，則說(shuō)明對(duì)應(yīng)的SNP位點(diǎn)上沒(méi)有“T”堿基。

   然后，再來(lái)看芯片上另一個(gè)對(duì)應(yīng)的，5’端最后一個(gè)堿基為“T”的捕獲探針：如果它發(fā)光，則說(shuō)明SNP位點(diǎn)上有“A”；如果它不發(fā)光，則SNP位點(diǎn)上沒(méi)有“A”。

   把兩個(gè)探針的發(fā)光情況綜合來(lái)看，如果兩個(gè)探針都發(fā)光，則說(shuō)明這個(gè)SNP位點(diǎn)是一個(gè)“A”和“T”的雜合子。如果5’位末端是A堿基的探針有上熒光，而5’位末端是T堿基的探針上沒(méi)有熒光，則可以判斷這個(gè)SNP位點(diǎn)上是一個(gè)“T”的純合子。反之，這個(gè)SNP位點(diǎn)是一個(gè)“A”的純合子。

   如果理解了A:T型SNP的區(qū)分原理。當(dāng)然也就很容易理解C:G型SNP的區(qū)分原理了。

   上述就是Axiom的檢測(cè)原理，歸納一下：就是通過(guò)連接酶，對(duì)連接位點(diǎn)上堿基匹配的情況進(jìn)行識(shí)別。只有堿基匹配，連接反應(yīng)才可以發(fā)生。

   如果堿基不匹配，則連接反應(yīng)不能發(fā)生。

   在Axiom的芯片當(dāng)中，CHB1和CHB2是兩款很常用的、針對(duì)中國(guó)人的SNP分型芯片。

   它們有130萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)，而（Affymetrix公司的）卡式SNP芯片的原理，與Axiom的檢測(cè)原理，是略有不同的。

   卡式芯片不是以連接反應(yīng)是否發(fā)生，作為檢測(cè)的依據(jù)。

   而是檢測(cè)目標(biāo)DNA片段，與捕獲探針，之間的雜交結(jié)果。

   在探針設(shè)計(jì)當(dāng)中，對(duì)SNP的兩種情況都設(shè)計(jì)相應(yīng)的探針。

   在實(shí)驗(yàn)過(guò)程當(dāng)中，先把基因組DNA分成2份。一份用Nsp I酶進(jìn)行消化；另一份用Sty I酶進(jìn)行消化。

   基因組DNA被消化成片段，之后，在兩頭連上接頭。

   進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增完了。之后，會(huì)得到長(zhǎng)度主要分別在 200BP ～1100BP 之間的擴(kuò)增片段。

   然后再用酶把 PCR 擴(kuò)出來(lái)的DNA片段進(jìn)行（再次）片段化。片段化完了之后，所得到的，應(yīng)該是平均長(zhǎng)度小于 180BP片到的的片段。

   接著用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase），把帶有生物素的單核苷酸，加到目標(biāo)片段上。

   然后，把這些帶了生物素標(biāo)簽的目標(biāo)DNA片段。與芯片進(jìn)行雜交，再染色、掃描。

   目標(biāo)DNA片段與捕獲探針雜交的，過(guò)程當(dāng)中，遵循堿基互補(bǔ)原則。如果完全匹配，則雜交效率高。雜交到捕獲探針上的目標(biāo)片段就會(huì)多。反之，如果有一個(gè)堿基是不匹配的，那么雜交效率就會(huì)低許多，雜交到捕獲探針上的目標(biāo)片段，也就會(huì)少許多。

   接下來(lái)，再經(jīng)過(guò)染色，染色完了之后，進(jìn)行激光掃描。

   掃描過(guò)程當(dāng)中，能發(fā)出熒光的探針，說(shuō)明樣本當(dāng)中有對(duì)應(yīng)基因形的DNA，如果探針不能發(fā)出熒光信號(hào)，或者發(fā)出的熒光信號(hào)很弱，則說(shuō)明樣本當(dāng)中沒(méi)有對(duì)應(yīng)基因型的DNA。

   如果一個(gè)SNP的兩種熒光探針都發(fā)光，而且發(fā)光強(qiáng)度差不多，則說(shuō)明樣本在這個(gè)位點(diǎn)是一個(gè)雜合子。

   以上就是卡式SNP芯片的檢測(cè)原理，在卡式SNP芯片當(dāng)中，“SNP 6.0”是一款很經(jīng)典的芯片。

   它上面有90多萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)的探針，并且同時(shí)還有94萬(wàn)個(gè)拷貝數(shù)變異探針。

   image
   image

   軟件

   Affymetrix 分析表達(dá)譜的軟件。

   主要是用的 Transciptome under galtetede軟件，簡(jiǎn)稱TAC軟件分析基因分型的軟件，主要是用 Genotyping Console軟件。

   除了表達(dá)譜芯片、和基因分型芯片之外。

   Affymetrix 公司還提供：microRNA芯片、基因調(diào)控芯片、拷貝數(shù)變異芯片

   分子細(xì)胞遺傳學(xué)芯片、藥物遺傳學(xué)芯片等，多種芯片。并且提供客戶定制化服務(wù)。

   3.Agilent生物芯片原理

   今天，會(huì)和大家談一下Agilent公司（安捷倫公司）的生物芯片。

   Agilent的生物芯片（系統(tǒng)）和別的公司的生物芯片（系統(tǒng)）一樣，同樣由：掃描儀、生物芯片、分析軟件，三部分組成。

   Agilent的芯片掃描儀，叫SureScan DX。SureScan DX已經(jīng)取得了歐洲的CE認(rèn)證，和中國(guó)的CFDA認(rèn)證，可以應(yīng)用于臨床。

   生產(chǎn)工藝

   接下來(lái)，我們介紹Agilent的芯片。首先，我們來(lái)看Agilent的芯片合成工藝。

   Agilent芯片的基片是一個(gè)玻璃片。它的大小和一張標(biāo)準(zhǔn)的病理載玻片一樣大小。

   它的芯片制作過(guò)程，是用和噴墨打印一樣的技術(shù)來(lái)進(jìn)行制作的。噴墨打印機(jī)，是在墨盒里面是裝了“紅、黃、藍(lán)、黑”四種顏色的墨水。而Agilent打印生物芯片的墨盒里面，是用帶保護(hù)基團(tuán)的A/C/G/T四種堿基底物，來(lái)代替了顏色墨水。

   image

   分別含有4種堿基底物的小液滴，被按照設(shè)計(jì)的探針序列，依次、層疊地噴到玻璃板的確定的位置上。

   在每一個(gè)堿基的延伸過(guò)程當(dāng)中都有3個(gè)步驟，分別是“脫保護(hù)基團(tuán)、偶聯(lián)、氧化”。

   
   
   image
   image
   image
   image

   先把一個(gè)堿基，噴到玻璃板上，然后，再噴上第二個(gè)堿基，讓兩個(gè)堿基之間發(fā)生偶聯(lián)。

   接下來(lái)，進(jìn)行氧化，把亞磷酸基團(tuán)氧化成磷酸基團(tuán)。

   然后，把連在第二個(gè)堿基5’位羥基上的DMT保護(hù)基團(tuán)給去掉。這樣，留下一個(gè)自由的5‘位羥基。有了這個(gè)羥基，就可以進(jìn)行下一步的延伸反應(yīng)了。

   不斷重復(fù)這個(gè)過(guò)程，DNA鏈就會(huì)不斷地延長(zhǎng)。

   Agilent的這個(gè)DNA鏈合成技術(shù)，每一步的合成效率都非常高，可以達(dá)到99%以上。這讓Agilent可以在芯片上，得到很長(zhǎng)的DNA鏈。最長(zhǎng)，可以達(dá)到300個(gè)堿基的長(zhǎng)度。

   image

   Agilent的這個(gè)方法得到的DNA鏈，它是3’端連到玻璃基片上的。

   Agilent的這個(gè)基于打印原理的芯片合成技術(shù)，給予Agilent公司在制作不同序列的探針的時(shí)候，有著極大的靈活性。只要更換芯片探針的設(shè)計(jì)文件，就可以輕松地制作出一張全新序列的芯片來(lái)。因此，Agilent公司在接受客戶定制化芯片的時(shí)候，可以接受少到“1張”芯片的定制化訂單。

   Agilent（目前）生產(chǎn)的芯片，可以根據(jù)點(diǎn)陣密度的不同，分成密度較低的HD芯片、和高密度的G3芯片。

   image

   HD芯片，一張芯片上最多可以有24萬(wàn)4千個(gè)點(diǎn),高密度的G3芯片，一張芯片上最多可以有1百萬(wàn)個(gè)點(diǎn)。

   而一張芯片上，又可以根據(jù)點(diǎn)陣的分區(qū)的情況，區(qū)分成：1個(gè)區(qū)的、2個(gè)區(qū)的、4個(gè)區(qū)的、和8個(gè)區(qū)的。分的區(qū)越多，則一張芯片上，可以同時(shí)檢測(cè)的樣本數(shù)就越多。但是分區(qū)越多，每個(gè)樣本可以檢測(cè)的數(shù)據(jù)點(diǎn)就越少。

   CGH芯片

   說(shuō)完了芯片制造的過(guò)程和大體規(guī)格，接下來(lái)，我們介紹Agilent芯片的應(yīng)用。

   我們先來(lái)說(shuō)CGH芯片，也就是“Comparative GenomicHybridization”芯片。翻成中文，就是“比較基因組雜交”芯片。

   CGH芯片，主要是檢測(cè)：雜合性缺失（LOH）、單親二染色體（UPD）、和拷貝數(shù)變異（CNV）。

   先說(shuō)一下，什么叫“雜合性缺失”。它的英文是“Loss Of Heterozygosity”，簡(jiǎn)稱“LOH”。

   正常情況下，常染色體上的一個(gè)區(qū)段，都會(huì)有來(lái)自于父親、和母親的各一個(gè)拷貝。

   當(dāng)發(fā)生雜合性缺失（LOH）的時(shí)候，兩個(gè)染色體上的同一個(gè)區(qū)段，都是來(lái)自于或者父親、或者母親的一方，而把另一方的對(duì)應(yīng)區(qū)段給丟失了。這就叫雜合性缺失（LOH）。

   
   
   image
   image

   雜合性缺失是腫瘤發(fā)病的重要病因。

   單親二染色體，也就是“Uniparental Disomy”，簡(jiǎn)稱“UPD”，是雜合性缺失的一種特殊形式。也就是一對(duì)染色體，都是來(lái)自于父親、或者母親中的一方，而把另一方的對(duì)應(yīng)染色體，全部給缺失了。

   這種變異的危害，和雜合性缺失的道理是一樣的。只是因?yàn)樗鼇G的是一整個(gè)染色體，所以致病的可能性會(huì)更高。

   拷貝數(shù)變異，Copy Number Variation，簡(jiǎn)稱“CNV”，是指一小段染色體片段的缺失，或者額外增加。

   image

   CGH芯片，主要就是檢測(cè)這三種突變：“LOH”、“UPD”、和“CNV”。

   在生物芯片檢測(cè)方法出來(lái)之前，染色體變異，主要是通過(guò)核型分析來(lái)做的。但是核型分析的分辨率是較低的，大約只能看到10M以上片段的缺失、或者增加。對(duì)于小于10M的片段缺失、或者增加，則無(wú)法在核型分析中發(fā)現(xiàn)。

   
   
   image
   image

   而用生物芯片的方法，則可以極大地提高檢測(cè)上述突變的分辨率、和靈敏度。分辨率最高可以達(dá)到發(fā)現(xiàn)一個(gè)外顯子的增加、或者缺失。

   Agilent CGH生物芯片工作的原理，就是把樣本的DNA片段化，標(biāo)上紅色熒光素“Cy5”；同時(shí)，再把來(lái)自幾十個(gè)正常人的基因組DNA，混成一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本，取同樣的DNA量，同樣片段化，標(biāo)上綠色熒素“Cy3”。

   image
   image
   image

   然后，把這兩種標(biāo)了熒光素的DNA片段，混合在一起，在同一張芯片上進(jìn)行雜交。

   接下來(lái)進(jìn)行激光掃描，比較紅光熒光與綠光熒光的光強(qiáng)。

   所得到的光強(qiáng)比值，換算成以2為底的Log值。

   如果在一個(gè)探針上，Log值接近于“0”，也就是說(shuō)，紅光與綠光的熒光光強(qiáng)差不多，那么，可以基本斷定，在這個(gè)位置，樣本中是有2個(gè)基因拷貝。

   如果在一個(gè)點(diǎn)上，Log值大約等于“1”，也就是說(shuō)紅光的光強(qiáng)，是綠光的2倍，那么說(shuō)明，樣本在這個(gè)位置的拷貝數(shù)，可能是標(biāo)準(zhǔn)品的2倍。也就是說(shuō)，樣本在這個(gè)位置，可能有4個(gè)基因拷貝，比正常情況多出了2個(gè)拷貝。

   同樣道理，在一個(gè)點(diǎn)上，如果Log值小于等于“-2”，也就是說(shuō)，紅光的強(qiáng)度只有綠光強(qiáng)度的“1/4”，甚至更低，那么說(shuō)明，樣本在這個(gè)位置的2個(gè)拷貝，可能都丟失了。

   image
   image

   因?yàn)閬?lái)自一個(gè)點(diǎn)的熒光的光強(qiáng)變化，可能會(huì)帶有一定的偶然性，所以，一般是看染色體空間位置上相鄰的三個(gè)點(diǎn)（或者更多的點(diǎn)），如果這三個(gè)點(diǎn)的熒光比值，都發(fā)生同一個(gè)方向的偏離，就可以作為判斷這一段有拷貝數(shù)變異的證據(jù)。

   說(shuō)完了拷貝數(shù)變異，我們進(jìn)一步來(lái)看LOH和UPD的情況。因?yàn)長(zhǎng)OH（雜合性缺失）和UPD（單親二染色體），并不會(huì)改變某一區(qū)段的基因拷貝數(shù)，所以，就有必要加入SNP分析，來(lái)探測(cè)LOH和UPD。

   如果染色體的一個(gè)區(qū)段內(nèi)，同時(shí)有大量的雜合子存在，那么一般可以判斷，這個(gè)區(qū)域沒(méi)有發(fā)生LOH；反之，一個(gè)區(qū)段內(nèi)，如果都是純合子，那么，很可能這個(gè)區(qū)段內(nèi)是發(fā)生了LOH（雜合性缺失）。

   Agilent的CGH芯片，區(qū)分SNP位點(diǎn)的方法，是通過(guò)“酶切+雜交”。

   把基因組DNA，用Alu I和Rsa I兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化。

   我們以Alu I這種酶為例，它切的位點(diǎn)是“AGCT”。

   如果基因組上的這個(gè)位點(diǎn)是CGCT的純合子，那它就不會(huì)被酶切斷。在后面雜交的過(guò)程當(dāng)中，因?yàn)镈NA鏈保持了完整的長(zhǎng)鏈，所以與探針的吸附能力就強(qiáng)，最后，（在激光掃描中），就得到高強(qiáng)度的熒光信號(hào)。

   如果基因組上這個(gè)位點(diǎn)，是CGCT和AGCT的雜合子，那么AGCT就會(huì)被切斷，而CGCT保持完整。在后面與探針的雜交過(guò)程當(dāng)中，保持完整長(zhǎng)鏈的鏈，可以雜交到探針上去，而被切斷鏈，它與探針雜交的序列就變短了，這樣，它與探針的吸附力就減弱，在后面的洗脫過(guò)程當(dāng)中，這個(gè)短鏈就會(huì)被洗掉。這樣，2個(gè)等位基因鏈中，只那個(gè)沒(méi)有被切斷的長(zhǎng)鏈會(huì)留在探針上，所以，最后的（激光掃描得到的）熒光強(qiáng)度，只有中等的強(qiáng)度。

   如果基因組上這個(gè)位點(diǎn)是一個(gè)AGCT的純合子，那它就會(huì)被酶完全切斷。并且在雜交（洗脫）過(guò)程當(dāng)中，它就會(huì)被洗脫掉，最后，探針上就沒(méi)有熒光，或者熒光強(qiáng)度非常低。

   這樣，通過(guò)“酶切+雜交”，CGH芯片就可以分辨出基因組上的SNP位點(diǎn)，并且進(jìn)一步判斷是否有LOH或者UPD發(fā)生。

   Agilent的最常賣的CGH芯片，是它的860K（SurePrint G3 Human CGH Microarray Kit,8x60K）、和4180K的芯片（SurePrint G3Human CGH Microarray Kit, 4x180K）。

   Agilent分析CGH芯片數(shù)據(jù)的軟件，是CytoGenomics軟件。

   表達(dá)譜芯片

   接下來(lái)，我們說(shuō)Agilent的表達(dá)譜芯片。

   Agilent表達(dá)譜芯片的檢測(cè)原理，是IVT原理，也就是“In Vitro Transcription”原理。

   首先，用帶有T7啟動(dòng)子序列的Poly（T）引物，與mRNA的Poly(A)尾巴結(jié)合，（逆）轉(zhuǎn)錄出第一鏈的cDNA。然后，再轉(zhuǎn)錄出第二鏈的cDNA，這樣，就得到了雙鏈cDNA。

   image
   image

   這個(gè)雙鏈的cDNA是帶有T7啟動(dòng)子的，接下來(lái)，就用這個(gè)T7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄出cRNA來(lái)。cRNA是complementary RNA，也就是“互補(bǔ)RNA”。

   在轉(zhuǎn)錄出cRNA的過(guò)程當(dāng)中，所用的底物是特殊的。在4種堿基當(dāng)中，C堿基不是天然的CTP，而是用標(biāo)有Cy3熒光基團(tuán)的合成CTP。這樣，Cy3熒光基團(tuán)就在體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程當(dāng)中，被帶入到新合成的cRNA鏈當(dāng)中去了。

   接下來(lái)，把這個(gè)cRNA鏈與芯片進(jìn)行雜交，雜交完了之后，在激光掃描儀下看每個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度。根據(jù)每個(gè)探針點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，反推出對(duì)應(yīng)基因的RNA表達(dá)量來(lái)。

   Agilent的表達(dá)譜芯片有以下幾個(gè)特點(diǎn)：

   第一，它的cRNA鏈上，標(biāo)的直接就是Cy3熒光基團(tuán)，而不是生物素，所以，它在與芯片雜交、洗脫完了之后，就可以直接上掃描儀進(jìn)行檢測(cè)。而不像別的用生物素進(jìn)行標(biāo)記的芯片平臺(tái)，還要經(jīng)過(guò)幾步的熒光染色過(guò)程，才能進(jìn)行激光掃描。所以Agilent的芯片處理過(guò)程，會(huì)比別的用生物素做標(biāo)簽的芯片平臺(tái)更快。一般Agilent只要2天就可以完成樣本處理、和芯片雜交過(guò)程，而別的芯片平臺(tái)，可能會(huì)要3天時(shí)間。

   第二，它的檢測(cè)線性范圍更大，可以達(dá)到10的5次方。相比之下，別的做表達(dá)譜的芯片平臺(tái)的檢測(cè)范圍，一般只有10的3次方。也就是說(shuō)，對(duì)于低表達(dá)的基因，安捷倫芯片的靈敏度更高。它可以檢測(cè)到比別的平臺(tái)低10倍的低表達(dá)量，對(duì)于高表達(dá)量的基因，Agilent芯片的檢測(cè)量程更寬。它可以比別的平臺(tái)，更準(zhǔn)確地測(cè)到高10倍的高表達(dá)量。

   image

   第三，Agilent的表達(dá)譜芯片上的探針，是60個(gè)堿基。因?yàn)橛辛吮葎e的芯片平臺(tái)更長(zhǎng)的探針，所以它的檢測(cè)特異性會(huì)更好。

   Agilent公司最常賣的人表達(dá)譜芯片，是：SurePrint G3 HumanGene Expression v3 8*60K MicroArray Kit。

   安捷倫分析表達(dá)譜的軟件，是GeneSpring軟件。

   Agilent公司除了提供：CGH芯片、和表達(dá)譜芯片之外，還提供：microRNA芯片、甲基化芯片、ChIP芯片、基因合成用的Oligo Library Synthesis芯片。有興趣的同學(xué)，可以向Agilent公司咨詢（www.agilent.com.cn）。