Davie K, Jacobs J, Atkins M, Potier D, Christiaens V, Halder G, Aerts S. Discovery of transcription factors and regulatory regions driving in vivo tumor development by ATAC-seq and FAIRE-seq open chromatin profiling. PLoS Genet. 2015 Feb 13;11(2):e1004994. doi: 10.1371/journal.pgen.1004994. PMID: 25679813; PMCID: PMC4334524.
增強(qiáng)子通過(guò)招募與之相結(jié)合的特定的轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)控基因的時(shí)空表達(dá)，當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子與活躍調(diào)控區(qū)相結(jié)合的時(shí)候，相應(yīng)區(qū)域的開(kāi)放性增強(qiáng)，變成開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)，從而調(diào)控基因的表達(dá)。那是否可以通過(guò)染色質(zhì)開(kāi)放性分析的方法對(duì)比正常生長(zhǎng)的組織與處理的組織，借此尋找組織特異性表達(dá)相關(guān)調(diào)控區(qū)域呢？
2015年，PLos Genetics發(fā)表文章《Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo TumorDevelopment by ATAC-seq and FAIRE-seqOpen Chromatin Profiling》，作者就是以此為思路，利用ATAC-seq與FAIRE-seq的方法進(jìn)行染色質(zhì)開(kāi)放性分析，通過(guò)對(duì)比野生型與不同腫瘤組織，并進(jìn)一步鑒定出于與之相關(guān)調(diào)控區(qū)域與調(diào)控元件。
研究結(jié)果
1、ATAC-seq、 FAIRE-seq都能很好的鑒定出已知的增強(qiáng)子
黑腹果蠅的眼盤作為一種研究基因時(shí)空表達(dá)與細(xì)胞分化的模式系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。作者同樣選擇了黑腹果蠅的眼盤為研究材料進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。首先利用兩個(gè)已被驗(yàn)證的增強(qiáng)子Optix? 和oculis (so) 來(lái)對(duì)比ChIP-seq、DNAse-seq、ATAC-seq與FAIRE-seq四種方法的優(yōu)良差異。結(jié)果顯示在眼觸角組織中，ATAC-seq、 FAIRE-seq都能很好的鑒定出兩種已知的增強(qiáng)子，而在胚胎組織中，DNAse-seq并未檢測(cè)出 (Fig. 1)。ATAC-seq與FAIRE-seq兩種方法的 peak called 高度重疊，且相應(yīng)峰高有著很強(qiáng)的相關(guān)性（Fig2A--D）。作者進(jìn)一步驗(yàn)證了ATAC-seq與FAIRE-seq兩種方法在鑒定啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、絕緣子方面的都能發(fā)揮相應(yīng)作用（Fig2E--G），兩種方法對(duì)較，發(fā)現(xiàn)ATAC-seq方法的效果更加顯著。
2、ATAC-seq技術(shù)在染色質(zhì)的開(kāi)放性分析、被保護(hù)核小體鑒定等方面作用獨(dú)特
在以CTCF為研究對(duì)象驗(yàn)證絕緣子過(guò)程中，ATAC-seq也可應(yīng)用于解析轉(zhuǎn)錄因子足跡和核小體包裝（Fig3）。在以往的研究中，在CTCF結(jié)合區(qū)域，ATAC-seq的信號(hào)降低，作者想要驗(yàn)證這種現(xiàn)象是否也存在于果蠅眼睛的形成中，作者發(fā)現(xiàn)在剪切位點(diǎn)上，CTCF的覆蓋度明顯下降，這表明，雖然這些區(qū)域通常都是開(kāi)放的，但是CTCF保護(hù)蛋白阻止了其被切割，進(jìn)一步闡明，高精度的ATAC-seq在鑒定調(diào)控區(qū)域中將會(huì)發(fā)揮重大作用。根據(jù)以往在體外對(duì)人體染色質(zhì)的研究，ATAC-seq可以關(guān)聯(lián)切割位點(diǎn)與核小體之間的距離，于是作者就評(píng)估是否對(duì)果蠅體內(nèi)的小的樣品進(jìn)行ATAC-seq也可以獲得相應(yīng)信息。通過(guò)對(duì)比Buenrostro et al.的研究，作者驚喜的發(fā)現(xiàn)，即使在低至0.5M的reads讀數(shù)的情況下，ATAC-seq依舊可以獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，證明了ATAC-seq技術(shù)在染色質(zhì)的開(kāi)放性分析、被保護(hù)核小體鑒定等諸多方面發(fā)揮了獨(dú)特的作用。
3、ATAC-seq、 FAIRE-seq可以鑒定腫瘤組織與野生組織中染色質(zhì)開(kāi)放性的變化
鑒于ATAC-seq、 FAIRE-seq的強(qiáng)大功能，作者以野生型與RasV12; scrib-/-癌癥模式（致癌蛋白R(shí)as過(guò)表達(dá)與scrib-/-隱形純合突變）為材料進(jìn)行研究，并通過(guò)對(duì)比早期腫瘤（RSE）、晚期腫瘤（RSL）與野生型開(kāi)放染色質(zhì)的差別，ATAC-seq結(jié)果顯示有4851個(gè)峰的極速增加與4984個(gè)峰的降低。而且， ATAC-seq的結(jié)果相對(duì)于FAIRE-seq而言，變化更加劇烈，更加精細(xì)。通過(guò)信息分析，上調(diào)表達(dá)的基因與染色質(zhì)區(qū)域的開(kāi)放緊密相關(guān)，下調(diào)的基因與染色質(zhì)開(kāi)放度下降的區(qū)域相關(guān)。這就表明染色質(zhì)區(qū)域的開(kāi)放與關(guān)閉與整個(gè)基因功能的表達(dá)關(guān)系密切。作者以p53內(nèi)的一個(gè)未知增強(qiáng)子為例證明了這個(gè)現(xiàn)象（Fig4）。總的來(lái)說(shuō)，通過(guò)ATAC-seq、 FAIRE-seq可以鑒定腫瘤組織與野生組織中染色質(zhì)開(kāi)放性的變化，并且許多內(nèi)源性的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的改變與基因的表達(dá)密切相關(guān)。
4、不同開(kāi)放染色質(zhì)對(duì)腫瘤發(fā)生的調(diào)控過(guò)程具有重要作用
已經(jīng)獲得調(diào)控區(qū)域的確切位置，作者利用i-cisTarget分析軟件對(duì)9713個(gè)候選的轉(zhuǎn)錄因子motifs進(jìn)行篩選，獲得了AP-1、 Stat92E、 Scalloped、Zelda和? Brf.,其中AP-1和Stat92E兩個(gè)TFmotifs 作為兩個(gè)主要的調(diào)控元件。在活躍但并未改變的調(diào)控區(qū)，Stat92E并未富集而AP-1也只是微量富集（NES=2.7），這就表明富集只是特定發(fā)生于活性改變了的調(diào)控區(qū)域。引人注目的是，在誘導(dǎo)腫瘤生成的調(diào)控區(qū)，AP-1大量匹配（81%），這就意味著其在腫瘤生成中的誘發(fā)作用。AP- 1在JNK去磷酸化下游活躍，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證明在RasV12; scrib-/-腫瘤的發(fā)展過(guò)程中JNK與AP-1的重要性，抑制JNK信號(hào)或者敲除AP-1 都可以阻斷腫瘤的擴(kuò)張。Stat92E motif富集于較少的調(diào)控區(qū)而且高度覆蓋了AP-1的應(yīng)答區(qū)，這與已知的RasV12; scrib-/-化是一個(gè)協(xié)同的通路不謀而合（Fig5A、B）。
隨后作者將野生型與不同腫瘤發(fā)育時(shí)期的活躍染色質(zhì)區(qū)進(jìn)行對(duì)比，探究是否隨著腫瘤的發(fā)展，這些區(qū)域是否更加活躍。并根據(jù)不同的增強(qiáng)子開(kāi)放程度講增強(qiáng)子分成四組：Upd組（Upd過(guò)表達(dá)后開(kāi)放的增強(qiáng)子）、Stable組（穩(wěn)定開(kāi)放的增強(qiáng)子）、ALL組（所有開(kāi)放的增強(qiáng)子）、Gradual組（逐步開(kāi)放的增強(qiáng)子）。作者發(fā)現(xiàn)，在Stable組，State92E富集高且高于AP-1，而在Gradual組，AP-1富集更加顯著（Fig5C）。作者對(duì)這種現(xiàn)象也做出了一定的假設(shè)，一方面可能是因?yàn)镾tate92E靶標(biāo)活化早于AP-1或者小部分入侵的腫瘤也仍然具有State92E 活性。總的來(lái)說(shuō)，在腫瘤發(fā)育時(shí)期基于不同開(kāi)放染色質(zhì)峰的motif分析推理提供了一個(gè)有效的途徑來(lái)對(duì)腫瘤發(fā)生的調(diào)控過(guò)程的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行研究，本篇作者所得到的結(jié)果也證明了AP-1與State92E在RasV12; scrib-/-誘導(dǎo)腫瘤形成的下游發(fā)揮了重要作用。
5、StateE92在腫瘤化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用
?作為JAK/STAT 信號(hào)通路的效應(yīng)子，Stat92E被證明參與了改變?nèi)旧|(zhì)區(qū)域的過(guò)程。以往研究也顯示當(dāng)阻斷JAK/STAT 信號(hào)通路，腫瘤癥狀被減少。然而Stat92E是如何直接參與這個(gè)過(guò)程的并沒(méi)有被證實(shí)。作者構(gòu)建了一個(gè)State92E突變的RasV12; scrib-/-腫瘤，發(fā)現(xiàn)腫瘤增長(zhǎng)減慢（Fig6A--C），而且，State92E喪失功能的幼蟲(chóng)甚至化蛹，這在以往的實(shí)驗(yàn)中是從未出現(xiàn)。隨后作者超激活JAK/STAT 信號(hào)通路，并將獲得的材料命名為Upd。通過(guò)對(duì)比誘導(dǎo)腫瘤形成導(dǎo)致的染色質(zhì)開(kāi)放性變化與過(guò)表達(dá)JAK/STAT 信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)這些變化大部分具有相同的方向，但是過(guò)表達(dá)所引起的染色質(zhì)開(kāi)放性改變相較于誘導(dǎo)腫瘤生成較弱。利用ATAC-seq，誘導(dǎo)腫瘤生成的處理中檢測(cè)的356個(gè)調(diào)控區(qū)，在過(guò)表達(dá)Upd中，72% 也有正向調(diào)控，說(shuō)明這些調(diào)控區(qū)是State92E的效應(yīng)區(qū)。而剩下的28%作者認(rèn)為，這部分是AP-1的調(diào)控區(qū)，State92E在其中不發(fā)揮作用。隨后作者想要知道這些調(diào)控區(qū)域的改變是否直接影響了基因的表達(dá)，作者在State92E的效應(yīng)調(diào)控區(qū)上下游5Kb的范圍內(nèi)確定了28個(gè)潛在的目的基因。這其中有至少七個(gè)基因在JAK/STAT 信號(hào)通路發(fā)揮了重要作用（Fig6D--F）。由此，作者認(rèn)為StateE92在腫瘤化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。
6、總結(jié)
這篇文章一方面揭示了ATAC-seq、FAIRE-seq在開(kāi)放染色質(zhì)分析中的強(qiáng)大作用，尤其ATAC-seq方法更展現(xiàn)出更強(qiáng)的優(yōu)越性，無(wú)論其更高 的信噪比、以及在轉(zhuǎn)錄因子足跡鑒定、轉(zhuǎn)錄因子鑒定等方面都展現(xiàn)出其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。同時(shí)利用ATAC-seq鑒定了State92E、AP-1在腫瘤生成中的重要作用，進(jìn)一步闡述了腫瘤生成的機(jī)理，為腫瘤研究提供了寶貴經(jīng)驗(yàn)。
測(cè)序數(shù)據(jù)
ATAC-seq, ChIP-seq and FAIRE-seq data for all conditions are available in GEO (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/geo/), with accession number GSE59078.
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參考鏈接：http://www.igenebook.com/news/376.html
