視頻鏈接：https://www.youtube.com/watch?v=XmHDexCtjyw&list=PLjiXAZO27elC_xnk7gVNM85I2IQl5BEJN&index=11
練習(xí)地址：https://github.com/NBISweden/excelerate-scRNAseq/blob/master/session-trajectories/session-trajectories.md

一、為什么要做軌跡分析以及軌跡分析的定義

在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的單細(xì)胞分析流程得到聚類結(jié)果后，可以進(jìn)行軌跡分析，并進(jìn)一步進(jìn)行基因表達(dá)分析。
但并不是只有聚類結(jié)果才可進(jìn)行軌跡分析，標(biāo)準(zhǔn)分析中的很多步驟都可以follow with軌跡分析。

在整個生命生長發(fā)育過程中，細(xì)胞都在不斷從一種功能“狀態(tài)”過渡到另一種功能“狀態(tài)”（如下圖）。處于不同狀態(tài)的細(xì)胞表達(dá)不同的基因，產(chǎn)生蛋白質(zhì)和代謝物的動態(tài)重復(fù)，從而完成它們的工作。當(dāng)細(xì)胞在不同的狀態(tài)間轉(zhuǎn)化時，會經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄重組的過程，一些基因被沉默，而另一些則被激活。這些瞬態(tài)通常很難描述，因?yàn)樵诟€(wěn)定的端點(diǎn)狀態(tài)之間凈化細(xì)胞可能很困難或不可能。但由于這個過程是連續(xù)發(fā)生的，我們可以使用軌跡推斷（TI，trajectory inference）的方法可以根據(jù)測序的細(xì)胞（瞬時狀態(tài)）之間表達(dá)模式的相似性對單細(xì)胞沿著軌跡進(jìn)行排序，以此來模擬細(xì)胞動態(tài)變化的過程。也就是重建分化軌跡或者擬時間軸。

但值得注意的是，并不是所有樣本都適合進(jìn)行軌跡分析。

比如我們明確知道骨髓中存在分化中間態(tài)的細(xì)胞（存在從干細(xì)胞到成熟細(xì)胞的分化過程），因此骨髓的樣本可以進(jìn)行軌跡分析。但一些樣本如PBMC中幾乎都是分化成熟的細(xì)胞，雖然也可以做軌跡分析，但是意義不大。此外，存在分化過程的細(xì)胞也有差別。比如B細(xì)胞到漿細(xì)胞的分化更像是一個線形過程，不存在分支（branch），所以B細(xì)胞不適合做branching。但Th細(xì)胞向其亞型的分化可能就存在多個分支。

自2014年以來，TI的各種算法得到飛速發(fā)展，至2018年已有接近60種方法。

Trajectory Inference主要方法的pipeline總結(jié)：主要包括兩個step：降維和軌跡建模

文獻(xiàn)：Computational methods for trajectory inference from single-cell transcriptomics

二、降維方法

降維的方法包括線性降維PCA，ICA等，和非線性降維TSNE，UMAP，DF等。在學(xué)習(xí)軌跡分析之前，先來了解兩種之前接觸的比較少的降維方法：ICA和DF。

1. ICA (Independent Component Analysis)獨(dú)立成分分析

ICA是數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的一種方法(A method for decomposing the data)。monocle1使用的就是ICA方法。

ICA與PCA比較類似，PCA（對高斯分布的數(shù)據(jù)效果較好）是將高變基因分配到主要的主成分中，用主成分來進(jìn)行后續(xù)分析。而ICA是將數(shù)據(jù)解構(gòu)，從混雜的信號中分離原始的多個生物信號。

PCA和ICA的區(qū)別：
主成分分析假設(shè)源信號間彼此非相關(guān)，獨(dú)立成分分析假設(shè)源信號間彼此獨(dú)立。
主成分分析認(rèn)為主元之間彼此正交，樣本呈高斯分布；獨(dú)立成分分析則不要求樣本呈高斯分布。

ICA的缺點(diǎn)：

1. ICA假設(shè)它找出來的生物信號都是相互獨(dú)立的。
2. 每個信號的來源都是非高斯分布。舉例來說，在教室中放一些麥克風(fēng)，在很多人都同時講話的時候，我們可以使用ICA來對混雜信號進(jìn)行解構(gòu)以判斷是誰在講話。這些混雜的聲音信號就是非高斯分布的。但是很多的生物學(xué)信號都是高斯分布的。對單細(xì)胞數(shù)據(jù)來說，也很難區(qū)分是高斯分布還是非高斯分布。

總結(jié)：ICA和PCA一樣，是一種線性降維方法。常被用于評估數(shù)據(jù)的原始組成。在ICA中，這些原始信號被認(rèn)為是互相獨(dú)立的，而且，ICA會先假定單細(xì)胞數(shù)據(jù)是非高斯分布的，實(shí)際上往往不是這樣。不同的信號在ICA分析中同等重要，但I(xiàn)CA不能確定實(shí)際有多少個信號源。

2. DF (Diffusion Maps)擴(kuò)散映射

Diffusion maps是一種非線性降維方法。
Diffusion maps原理講解視頻：https://www.bilibili.com/video/av38891467/

Diffusion Map用的是Diffusion Process的方法。如果兩個點(diǎn)距離較近，則從一個點(diǎn)隨機(jī)行走到一個點(diǎn)的概率就大。反之，如果兩個點(diǎn)距離較遠(yuǎn)，則從一個點(diǎn)隨機(jī)行走到一個點(diǎn)的概率就小。Deffusion Map就是這樣將兩個點(diǎn)之間的距離轉(zhuǎn)換成它們之間能夠產(chǎn)生隨機(jī)行走的概率 ，并用這個隨機(jī)行走的過程去捕捉數(shù)據(jù)的neighborhood結(jié)構(gòu)，從而將一個高維的扭曲的數(shù)據(jù)展開，變成一個低維的visualization。

簡單來說，為了把可能性轉(zhuǎn)化成距離，DM可以計算B到C的可能性，再計算A到C的可能性。根據(jù)公式，如果兩種可能性差不多大，那么他們的差值就趨于0。說明A到B的過程可以通過C來很好的連接起來。

DM是一種非線性降維（UMAP和tSNE也是非線形降維）。點(diǎn)和點(diǎn)之間（也就是細(xì)胞和細(xì)胞之間的距離）是通過probability來計算的。

三、定義軌跡

在學(xué)習(xí)了ICA和DM兩種降維方法后，現(xiàn)在我們想要建立細(xì)胞之間的關(guān)系，定義軌跡應(yīng)該從哪里開始，在哪里結(jié)束。

1. MST (minimum spamming tree)

舉個例子：下圖中有很多點(diǎn)，每個點(diǎn)之間的距離都可以計算（比如使用DM來計算點(diǎn)和點(diǎn)之間的possibility）。將點(diǎn)連線，尋找一個所有的點(diǎn)之間距離加和最小的連接方式，得到的結(jié)果如黑色的粗線所示，這就是最小生成樹。細(xì)胞數(shù)目越多，MST的軌跡構(gòu)建越準(zhǔn)確。

monocle1中使用的就是這種方式。如下圖a：每個細(xì)胞都代表了高維空間中的一個點(diǎn)，將高維空間降維（使用PCA/ICA或UMAP/TSNE），隨后使用MST定義細(xì)胞軌跡，并將細(xì)胞按照MST構(gòu)建的生成樹排序，標(biāo)注上細(xì)胞類型，就可以得到細(xì)胞軌跡。

The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells

但值得注意的是，MST只能構(gòu)建細(xì)胞軌跡，但不能告訴你端點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)還是終止點(diǎn)，也就是不知道是從哪個方向向哪個方向分化。所以如果有先驗(yàn)知識（比如干細(xì)胞向別的細(xì)胞分化），就會容易很多。
此外，由于MST沒有循環(huán)，所以不適用于增殖細(xì)胞（細(xì)胞周期）樣本。

2. RGE(Reverse graph embedding, i.e. DDRTree and others)

第二種方法叫做反向圖嵌入。
如下圖A和B：在使用MST進(jìn)行軌跡推斷時，由于最小生成樹高度依賴于每個點(diǎn)的位置和點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離，僅僅只是某個點(diǎn)的位置有些微變化就會得到完全不同的細(xì)胞軌跡。而REG的方法（圖C）則是先對細(xì)胞進(jìn)行聚類，再對細(xì)胞群的平均值進(jìn)行軌跡構(gòu)建。

TSCAN: Pseudo-time reconstruction and evaluation in single-cell RNA-seq analysis

Monocle2中使用的就是RGE方法(DDRTree)。

Reversed graph embedding resolves complex single-cell trajectories

上圖顯示的是RGE的工作原理。每個細(xì)胞都代表了高維空間中的一個點(diǎn)，使用PCA或其他方法來對細(xì)胞進(jìn)行降維后，根據(jù)假定的細(xì)胞cluster的中心點(diǎn)來對軌跡進(jìn)行構(gòu)建。隨后計算細(xì)胞到假設(shè)軌跡的距離，并將細(xì)胞分配到距離細(xì)胞最近的軌跡cluster上，分配完成后對中心點(diǎn)進(jìn)行更新，重建軌跡，再將二維軌跡投射到多維空間里，比較與原始數(shù)據(jù)的契合度，如果match的不好，就重新降維和構(gòu)建軌跡，循環(huán)這個過程，直到細(xì)胞軌跡能充分反映原始data（類似降維中的TSNE和UMAP循環(huán)）。這時就可以選擇軌跡的root（需要先驗(yàn)知識），并對擬時間軸或者發(fā)育軌跡進(jìn)行定義。根據(jù)軌跡圖中的分叉，還可以定義cell fate。

REG還衍生出了許多方法，比如PAGA、Slingshot、TSCAN、CellRouter等。

Monocle3進(jìn)行聚類的原理與Monocle2類似
Monocle3的工作流程：scRNAseq數(shù)據(jù) --> 預(yù)處理（標(biāo)準(zhǔn)化+PCA）--> 降維 --> 聚類 --> 擬時間軸的建立（DDRTree、SimplePPT、L1-graph）--> 差異分析

和Monocle2相比，Monocle3的主要update：

3. RNA velocity (gene expression trajectory)

RNA velocity是基于真實(shí)的轉(zhuǎn)錄動力學(xué)，可用于細(xì)胞基因表達(dá)的動態(tài)分化的研究。

RNA velocity of single cells

如上左圖，剛轉(zhuǎn)錄出的mRNA包含外顯子和內(nèi)含子，經(jīng)過splicing切除內(nèi)含子后，得到用于編碼蛋白的spliced mRNA。spliced mRNA的豐度由未成熟mRNA的splicing速度和降解速率共同決定。如上中圖：每個點(diǎn)代表一個細(xì)胞，在擬時間軸上，未經(jīng)過剪切的mRNA的出現(xiàn)始終早于經(jīng)過剪切的mRNA。如上右圖：紅色代表未經(jīng)過剪切的mRNA，藍(lán)色代表經(jīng)過剪切的mRNA，可以看出，這些細(xì)胞的應(yīng)該是從左往右分化的，因此Velocity可以用于定義軌跡的起點(diǎn)分支和終點(diǎn)。也就是說，Velocity可以在不知發(fā)育過程的前提下，預(yù)測譜系的方向（如下圖）。

RNA velocity of single cells

Velocity可以用于周期的軌跡

RNA velocity of single cells

總結(jié)：

Which method should I use?

A comparison of single-cell trajectory inference methods

A comparison of single-cell trajectory inference methods