劉小澤寫于19.6.10-課程框架介紹
筆記目的：根據生信技能樹的單細胞轉錄組課程探索smart-seq2技術相關的分析技術
課程鏈接在：http://jm.grazy.cn/index/mulitcourse/detail.html?cid=53
整個課程的框架
分為了5個單元，目前更新了3個單元，其中第一單元為背景介紹，包括單細胞轉錄組近10年的發展歷程，以及兩大主流技術smart-seq2（力求檢測到單個細胞的基因數量）和10x（追求檢測到的細胞數量）的介紹；第二單元加入了常規轉錄組的分析流程；第三單元重點利用smart-seq2技術得到的結果，結合三個R包進行分析；未來第4個單元將會整合公共數據庫(TCGA、METABRIC)以及文獻中的數據集進行整合分析；最后一部分就是展望，介紹10X的數據分析
蓬勃發展的單細胞轉錄組
與普通bulk轉錄組最大的區別就是：普通的是以一群細胞為一個樣本，最后得到結果是一個均值，而單細胞將精度提高，將一個細胞作為一個樣本，從而可以看出細胞的異質性
目前單細胞領域文章發表量迅速升高，有的團隊一年可以出8-9篇CNS，最著名就是北大的湯富酬教授研究發育生物學領域，另外腫瘤、免疫研究相關也十分火熱
不管怎樣，單細胞轉錄組數據到了生信工程師手中，即使生物背景知識可能不完全理解，但他確實可以通過數據分析去說明某些事情。
首先原始數據產出就有兩種主流途徑：測更多的細胞(以10X為主打)和測更多的基因(以smart-seq2為主打)；
然后數據就要經過一系列的質控才能開始上游分析，也就是預處理階段 ，也是兩種方法：UMI、ERCC。因為單細胞精度太高，每個細胞都是獨特的，和普通的Bulk RNA-seq不同，材料不容易獲得，不太好做重復，因此通過生物學重復來評價技術手段/數據質量的方法不靠譜。
- UMI即unique molecular identifier，是一段隨機序列，每一個DNA分子都有自己的UMI序列。可以大大降低PCR誤差（比如：原來兩個樣本中某基因表達量相同，但是由于兩個樣本擴增效率不同，樣本1為99%，樣本2只有95%，那么同時擴增40個循環，這同一個基因就有了
0.99^40 / 0.95^40 = 5.2倍差異，因此本來沒有差異也會因為外界因素擴增效率的影響而產生“假陽性”）；設計不同標簽的數量，大大超過待擴增的轉錄本，產生獨特標記的分子，并允許控制擴增偏差【例如10-mer的UMI，就會有 4的十次方 約等于100萬種變化】 - ERCC就是外源RNA對照聯盟開發的人工設計好的已知序列和數量的mRNA，高的ERCC含量與低質量數據相關，并且通常是排除的標準
關于QC的注意點：
QC不是僅僅對于下機的fq數據有效，它要在每一個分析環節都有體現。
主要包括：
- 一般的diagnostic plots: GC content, adapter, kmer, duplicated, base pair quality
- mapping reads/rate
- total sequencing reads (library size)
- the number of detected genes：檢測dropouts，也就是實際有表達卻沒被檢測到的基因
- ERCC spike-ins content
- the percentage of housekeeping genes, cell cycle genes, highly expressed genes, mitochondrial genes
- overall gene expression patterns
質控的表達矩陣要進行歸一化，因為不同的細胞有不同特征，另外實驗條件也不同；這對于解釋單細胞數據是至關重要的。單細胞的樣本量相比bulk實在小太多，因此更容易引入技術噪音，這個必須去除；
加入了降維這重要的一步，因為細胞數量太多，也就是要分析的樣本數量要幾百甚至幾千，于是會產生幾百或幾千的維度(可以試想一下常見的三維、四維空間)；
找差異基因、找marker基因(和差異基因不同，它不需要有差異，只需要有重要的生物學意義)、根據基因重要性進行細胞分群
看文獻
構建文庫
綜述：Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. 2017, （doi: 10.1016/j.molcel.2017.01.023.）
涉及到了6中文庫構建方法（CEL-seq2, Drop-seq, MARS-seq, SCRB-
seq, Smart-seq, and Smart-seq2），可以再結合相關的每一個文庫找6篇文章
文章發現：Smart-seq2可以在每個細胞中找到最多的基因，同樣費用比較高；檢測少量細胞時，MARS-seq、SCRB-seq、Smart-seq2更有效
歸一化
文獻1：Assessment of Single Cell RNA-Seq Normalization Methods，2017 (doi: 10.1534/g3.117.040683)
評價了幾種歸一化方法：
- fragments per kilobase of transcript per million mapped
reads (FPKM)(Mortazavi et al., 2008) - upper quartile (UQ)(Bullard et al., 2010)
- Trimmed mean of M-values (TMM)(Robinson and Oshlack, 2010)
- DESeq(Love et al.,2014)
- removed unwanted variation (RUV)(Risso et al., 2014)
- gamma regression model (GRM)(Ding et al., 2015).
文獻2：Performance Assessment and Selection of Normalization Procedures for Single-Cell RNA-Seq, 2019 (DOI:https://doi.org/10.1016/j.cels.2019.03.010)
主要研究了scone方法：a flexible framework for assessing performance based
on a comprehensive panel of data-driven metrics
(http://bioconductor.org/packages/scone/)
另外方法還有很多，比如：LSF(Lun Sum Factors)，BigNorm, Scnorm, BASiCS, RLE(size factor relative log expression)
降維
PDF: https://lib.ugent.be/fulltxt/RUG01/002/349/740/RUG01-002349740_2017_0001_AC.pdf 值得好好閱讀，講了許多關于降維原理和應用的知識
文中1.5.1部分（Clustering high-dimension to identify subtypes）寫出：
Importantly, the reduced dimensionality data are less noisy than the high-dimensional data bust lose some of the biological variance.
文章1：PCA, MDS, k-means, Hierarchical clustering and heatmap.
文章2：Outlier Preservation by Dimensionality Reduction Techniques
"MDS best choice for preserving outliers, PCA for variance, & T-SNE for clusters"
鑒定細胞群
每個術語都對應一篇文獻
- 降維：PCA、tSNE、DM(Diffusion maps)
- feature selection：M3Drop(Michaelis-Menten Modelling of Dropouts)、HVG(Highly variable genes)、Spike-in based methods、Correalated expression
- Seurat：is an R package designed for the analysis and visualization of single cell RNA-seq data. It contains easy-to-use implementations of commonly used analytical techniques, including the identification of highly variable genes, dimensionality reduction (PCA, ICA, t-SNE), standard unsupervised clustering algorithms (density clustering, hierarchical clustering, k-means), and the discovery of differentially expressed genes and markers.
- SC3：SC3 achieves high accuracy and robustness by consistently integrating different clustering solutions through a consensus approach. Tests on twelve published datasets show that SC3 outperforms five existing methods while remaining scalable, as shown by the analysis of a large dataset containing 44,808 cells. Moreover, an interactive graphical implementation makes SC3 accessible to a wide audience of users, and SC3 aids biological interpretation by identifying marker genes, differentially expressed genes and outlier cells.
- tSNE+kmeans
- SNN-Clip: doi: 10.1093/bioinformatics/btv088
- SINCERA: SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis.
綜述：A systematic performance evaluation of clustering methods for single-cell RNA-seq data (SC3 and Seurat show the most favorable results)
關于各種單細胞工具：https://www.scrna-tools.org/
文章在：Exploring the single-cell RNA-seq analysis landscape with the scRNA-tools database
