真核生物大部分基因含有內含子，轉錄完成后產生的mRNA前體需要經過一系列復雜的加工，成為成熟的mRNA，轉移到細胞質中才能發揮功能。可變剪接（Alternative Splicing，AS）是指從一個mRNA前體中通過不同的剪接方式，對外顯子和內含子進行組合，產生不同的mRNA剪接異構體的過程。可變剪接受到具有特殊結構域的順式調控元件（RNA motif）和識別這些motif的RNA結合蛋白（RNA binding protein）調控 。RNA-seq通常是二代轉錄組，可以通過高深度的測序數據組裝構建轉錄本序列，預測外顯子與內含子的結構并識別出可變剪接模式，假陽性不小。相比之下，三代全長轉錄組利用其讀長更長的優勢，可以直接讀取轉錄本的全長序列，無需打斷、組裝，直接獲得全長轉錄本的結構信息，能夠更加準確的分析生物體內存在可變剪接事件。選擇哪種測序方式需要考慮實際情況綜合考慮。
rMATS
rMATS是一款對RNA-Seq數據進行差異可變剪切分析的軟件。其通過rMATS統計模型對不同樣本（有生物學重復的）進行可變剪切事件的表達定量，然后以likelihood-ratio test計算P value來表示兩組樣品在IncLevel（Inclusion Level）水平上的差異(從公式上來看，IncLevel跟PSI的定義也是類似的)，lncLevel并利用Benjamini Hochberg算法對p value進行校正得FDR值。
安裝
conda activate py2
conda install rmats
conda install rmats2sashimiplot
運行
mkdir -p $output/4.4.4_rmats
echo $output/4.3.1_Tophat2/A_rep1.uniq.sorted.bam,$output/4.3.1_Tophat2/A_rep2.uniq.sorted.bam,$output/4.4.1_Tophat2/A_rep3.uniq.sorted.bam>$output/4.4.4_rmats/A.txt
echo $output/4.4.1_Tophat2/B_rep1.uniq.sorted.bam,$output/4.4.1_Tophat2/B_rep2.uniq.sorted.bam,$output/4.4.1_Tophat2/B_rep3.uniq.sorted.bam>$output/4.4.4_rmats/B.txt
mkdir -p $output/4.4.4_rmats/A_vs_B
rmats.py --b1 $output/4.4.4_rmats/A.txt --b2 $output/4.4.4_rmats/B.txt --gtf $dir_geo/4_Bowtie2/XXX.genome.gtf --od $output/4.4.4_rmats/A_vs_B -t paired --readLength 125 --cstat 0.0001 --nthread 6 --tmp $output/4.4.4_rmats/A_vs_B
mkdir -p $output/4.4.5_rmats2sashimiplot/
mkdir -p $output/4.4.5_rmats2sashimiplot/A_vs_B
rmats2sashimiplot --b1 $output/4.4.1_Tophat2/A.uniq.sorted.bam,$output/4.4.1_Tophat2/A_rep2.uniq.sorted.bam,$output/4.4.1_Tophat2/A_rep3.uniq.sorted.bam --b2 $output/4.4.1_Tophat2/B_rep1.uniq.sorted.bam,$output/4.4.1_Tophat2/B_rep2.uniq.sorted.bam,$output/4.4.1_Tophat2/B_rep3.uniq.sorted.bam -t SE -e $output/4.4.4_rmats/A_vs_B/SE.MATS.JC.txt --l1 A --l2 B --exon_s 1 --intron_s 1 -o $output/4.4.5_rmats2sashimiplot/A_vs_B
結果
MATS的結果文件是以各個可變剪切事件的分布的，主要由AS_Event.MATS.JC.txt，AS_Event.MATS.JCEC.txt，fromGTF.AS_Event.txt，JC.raw.input.AS_Event.txt，JCEC.raw.input.AS_Event.txt這幾類；其中JC和JCEC的區別在于前者考慮跨越剪切位點的reads，而后者不僅考慮前者的reads還考慮到比對到沒有跨越剪切位點的reads，但一般僅使用最重要的.Event.MATS.JC.txt的結果（如果只是單純的比較兩組樣品間可變剪切的差異的話；最后采用rmats2sashimiplot對結果繪圖。
ASprofile
ASprfile軟件對由StringTie對Hisat2的比對結果進行拼接的結果文件獲取每個樣本存在的可變剪接類型及相應表達量。
安裝
wget https://ccb.jhu.edu/software/ASprofile/ASprofile.tar.gz
tar -zxvf ASprofile.tar.gz
cd ASprofile.*
