Characterization of Genomic Alterations in Colorectal Liver Metastasis and Their Prognostic Value

結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移的基因組改變的特征及其預(yù)后價值

發(fā)表期刊：Front Cell Dev Biol

發(fā)表日期：2022 Jul 4

影響因子：6.081

DOI:? 10.3389/fcell.2021.760618

一、研究背景

????????結(jié)直腸癌（CRC）是全世界最常見的癌癥之一，轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致CRC患者死亡的主要原因。肝臟是結(jié)直腸癌遠處轉(zhuǎn)移最常見的位置，因為它離結(jié)直腸很近，轉(zhuǎn)移到肺部、骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)的情況較少。Vermaat等人的研究表明，原發(fā)性CRC和相匹配的肝轉(zhuǎn)移灶之間已知參與癌癥途徑的基因突變存在明顯差異。

????????然而，CRLM的預(yù)后和治療反應(yīng)各不相同，需要根據(jù)風(fēng)險對患者進行分層，以進行適當(dāng)?shù)膫€體化治療。一些臨床評分，通常基于術(shù)前癌胚抗原（CEA）值、切除邊緣、原發(fā)腫瘤部位、腫瘤TNM分期（T：起源的大小和是否侵犯附近組織；N：受累的附近淋巴結(jié)；M：遠處轉(zhuǎn)移）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小，旨在評估CRLM患者的狀況和預(yù)測預(yù)后。

二、材料與方法

1、數(shù)據(jù)來源

1） 北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院：共有146名患者被納入，平均年齡為57.62歲，腫瘤起源于左側(cè)結(jié)腸，84名腫瘤起源于右側(cè)結(jié)腸

2） 公共數(shù)據(jù)：MSKCC隊列的NGS臨床數(shù)據(jù)從GEO數(shù)據(jù)庫下載

2、分析流程

1） 二代測序

2） 突變調(diào)用：使用Illumina bcl2fastq軟件對測序數(shù)據(jù)進行解復(fù)用，然后用Trimmomatic進行分析，去除低質(zhì)量（質(zhì)量<15）或N堿基；用Burrows-Wheeler Aligner（bwa-mem）將數(shù)據(jù)與hg19參考人類基因組進行比對；用Picard套件和GATK用默認(rèn)參數(shù)進行處理；在IGV中確認(rèn)真實性；基因組改變的可視化用maftools進行；使用VEP軟件對突變信息進行注釋；進一步利用ANNOVAR豐富突變的注釋結(jié)果

3） 基于突變的基因特征構(gòu)建：LASSO算法被應(yīng)用于建立基于突變的基因簽名

4） 統(tǒng)計數(shù)據(jù)：生存分析；單變量或多變量的Cox回歸分析

三、實驗結(jié)果

01 - 結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移瘤的基因組改變

????????作者共分析了144個結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移瘤，詳細(xì)的基因組改變顯示在圖1A,B。TP53（83%）、APC（69%）、KRAS（43%）和SMAD4（17%）是CRLMs中最常見的突變。TP53和KRAS的主要突變類型是錯義突變，而APC的主要突變類型是框架移位插入。此外，從MSKCC隊列中提取了CRLMs患者的數(shù)據(jù)，并重新分析了樣本的基因組改變。在MSKCC隊列中，TP53（82%）、APC（80%）、KRAS（38%）和PIK3CA（18%）是CRLMs患者中最頻繁突變的基因。

圖1 不同隊列常見突變的基因的分布和突變的頻率

????????考慮到RAS激活和p53功能喪失在結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的協(xié)同作用，還探討了RAS和TP53同時突變對CRLM預(yù)后的影響。驅(qū)動性KRAS突變是CRLM患者總生存期的預(yù)測指標(biāo)（補充圖S1A,B）。此外，RAS和TP53的雙重突變不是CRLM患者生存率降低的獨立預(yù)測因素（圖S1E）。

補充圖S1

????????接下來，還對致癌信號通路進行了研究。RTK-RAS是受影響最大的致癌途徑，在內(nèi)部CRLM隊列中擁有最多的基因突變（圖2A）。在RTK-RAS通路中發(fā)生改變的基因中，大多數(shù)是CRLM隊列中的致癌基因（圖2B）。與沒有RAS-RAF通路改變的患者相比，有RAS-RAF通路改變的患者的總生存結(jié)局是不利的（補充圖S2A,B）。還分析了SMAD家族基因突變以及內(nèi)部隊列中SMAD通路和RAS-RAF通路改變的綜合影響，SMAD通路的改變對CRLM患者的總生存期沒有明顯影響（補充圖S2C,D）。在SMAD途徑和RTK-RAS途徑都有改變的患者，其預(yù)后與這兩個途徑都沒有突變的患者明顯不同（補充圖S2）。

圖2 RTK-RAS途徑中的致癌途徑變化和特定基因改變

補充圖S2

02 - 原發(fā)腫瘤部位的基因組差異

????????對左側(cè)和右側(cè)結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移患者的總基因突變負(fù)擔(dān)和常發(fā)突變部位進行了分析。比較了CRLM和TCGA隊列中的腫瘤的TMB值。與源自右側(cè)的結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移瘤相比，源自右側(cè)的結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移瘤的腫瘤突變負(fù)擔(dān)（TMB）值更大（圖3A）。在CRLM中10個最顯著突變的基因中，TCF7L2在右側(cè)（29.2%）的改變頻率明顯高于左側(cè)（9.2%）的腫瘤（圖3B）。FBXW7突變頻率在起源于左側(cè)的CRLM（14.2%）和起源于右側(cè)的CRLM（0%）之間有微小的顯著差異（圖3B）。然后，比較了源自左側(cè)和右側(cè)的CRLMs中50個最顯著突變的基因。共包括75個基因。在這75個基因中，KRAS、AMER1、NSD1、EPPK1、PIK3R1、ACVR2A、EPHB1、HNF1A、EZH1和CD1D的突變在源自右側(cè)的CRLMs中富集（圖3C）。

圖3 按主要部位分類的基因組改變

03 - 建立基于突變的CRLM患者總生存率的基因簽名

????????用單變量Cox分析來分析基因突變和總生存率之間的關(guān)系。在整個內(nèi)部隊列中，超過3%的樣本發(fā)生突變的基因被篩選出來，然后進行單變量Cox回歸。總共有八個基因突變在CRLM患者中顯示出不利的總體生存結(jié)果（圖4A）。進行LASSO Cox回歸，用六個基因建立了一個基于突變的基因特征（圖4B,C）。內(nèi)部CRLM隊列的患者被分層為高風(fēng)險（至少一個基因突變）和低風(fēng)險組（六個基因都沒有突變）。KM分析和單變量Cox回歸顯示，與至少有一個基因突變的患者相比，沒有這六個基因突變的患者具有有利的總生存結(jié)果（圖4D）。這六個基因的詳細(xì)突變類型見圖5E。錯義突變是BRCA2、KRAS、TSC2和PIK3CA中最常見的突變類型，而無義突變是PIK3R1和LATS2中最常見的。通過基于突變的基因簽名，在內(nèi)部的結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移隊列中，關(guān)于肝切除的總生存率，可以將患者分為高風(fēng)險和低風(fēng)險組（圖4F）。為了進一步驗證基于突變的基因特征，作者將其應(yīng)用于一個外部隊列。在MSKCC結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移隊列中被歸類為高風(fēng)險（至少一個基因突變）的患者與被歸類為低風(fēng)險（無突變）的患者相比，總的生存結(jié)果是不利的（圖4G）。

圖4 基于突變的基因特征構(gòu)建

04 - 建立Mut-CS評分系統(tǒng)以改善風(fēng)險評估和分層

????????將基于突變的基因特征和臨床變量結(jié)合起來，建立一個Mut-CS評分系統(tǒng)，以改善風(fēng)險評估和分層

????????KM圖和單變量Cox回歸顯示，在內(nèi)部CRLM隊列中，F(xiàn)ong-CRS和原發(fā)部位對患者的生存進行了分層（圖5A，B）。在內(nèi)部CRLM隊列中，與右側(cè)原發(fā)腫瘤患者相比，左側(cè)原發(fā)腫瘤患者的生存率較高。此外，F(xiàn)ong-CRS較高（>2）的患者與Fong-CRS較低（≤2）的患者相比，其生存狀況略顯不利。

????????Fong-CRS是臨床實踐中的一個有用工具。最近，一項研究提出了擴展臨床評分（e-CS）的概念，考慮到轉(zhuǎn)移的大小、淋巴結(jié)狀態(tài)和RAS/RAF途徑以及SMAD家族的改變。作者建立了一個新的mut-CS計分系統(tǒng)：轉(zhuǎn)移的大小（>5厘米為1分）+淋巴結(jié)狀態(tài)（>陽性為1分）+原發(fā)部位（右側(cè)為1分）+轉(zhuǎn)移數(shù)目（>1為1分）+CEA值（>200為1分）+轉(zhuǎn)移狀態(tài)（同步為1分）+∑系數(shù)（基因突變i）（來自圖4C）×突變狀態(tài)，并比較Fong-CRS得分的預(yù)測能力。e-CS、原發(fā)部位、合并RAS和TP53突變以及mut-CS評分系統(tǒng)的預(yù)測能力（圖5C）。mut-CS系統(tǒng)的平均預(yù)測能力大于Fong-CRS、e-CS、合并RAS和TP53突變以及其他臨床特征。KM和單變量Cox回歸分析顯示，mut-CS高（>3）的患者預(yù)后差（圖5D）。

圖5 建立mut-CS評分系統(tǒng)

四、結(jié)論

????????總之，作者揭示了CRLMs的基因組改變，這為不同原發(fā)腫瘤部位的轉(zhuǎn)移所看到的臨床差異提供了潛在的生物學(xué)解釋，并能夠確定預(yù)后因素。mut-CS評分系統(tǒng)結(jié)合了Fong-CRS、原發(fā)部位和基于突變的基因簽名，與現(xiàn)有的Fong-CRS相比，顯示了對個別患者風(fēng)險評估的改進。作者希望本報告中描述的基于突變的基因簽名和mut-CS評分系統(tǒng)能夠成為識別高風(fēng)險CRLM患者的有用工具，這些患者可能從輔助治療中獲益，并有助于CRLMs的個性化管理。