Abstract

DNA甲基化是非常保守的表觀修飾，對于基因調控及基因組穩定性十分重要
異常的DNA甲基化模式會導致植物的發育缺陷。一個特定的DNA甲基化狀態是由從頭甲基化、甲基化維持以及主動去甲基化的動態調控所實現的，這些過程受到多個酶的催化，并且受到不同調控通路的調控。本綜述主要討論了植物中的DNA甲基化，包括甲基化和去甲基化酶以及調控因子，還有一個甲基化和去甲基化共同協作的機制（甲基化穩態調控）；DNA甲基化對于轉座沉默、基因表達及染色體互作的作用；DNA甲基化在植物發育中所扮演的角色；以及DNA甲基化參與植物對生物及非生物脅迫的響應。

Introduction

5號位置胞嘧啶的DNA甲基化作用于核基因表達的表觀調控及基因組穩定性。包括DNA甲基化、組蛋白修飾、組蛋白變異及一些非編碼RNA改變在內的表觀變化會影響染色質結構，進而影響遺傳信息的可接近性。因此，DNA甲基化對于許多生物學過程是非常重要的，破壞DNA甲基化能夠導致動植物發育不正常，比如西紅柿果實成熟、老鼠胚胎致死等。
DNA甲基化在動植物中十分保守，基因組DNA甲基化精細模式對于發育是非常重要的。在動植物中，DNA甲基化由保守的DNA甲基化轉移酶利用S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體進行催化，而主動DNA去甲基化則涉及到一個堿基切除修復機制。一個由RNA指導的DNA甲基化通路對于植物中的從頭甲基化至關重要，但在哺乳動物中卻不是很重要。與哺乳動物相反，哺乳動物中的主動DNA去甲基化由5-甲基胞嘧啶（5-mC）的氧化作用和脫氨作用起始，而植物則利用5-mC DNA糖基酶直接切除5-mC堿基。

一個特異性DNA甲基化狀態反映了甲基化建立、維持和主動去除的動態調控的結果。這些過程受到多個酶的催化，并且由不同通路靶向到特異性基因組區域。植物DNA甲基化發生在所有的胞嘧啶序列上，包括三種類型，即CG、CHG和CHH，其中H代表了A、T或C。在擬南芥中，全基因組范圍的DNA甲基化特征主要是異染色質中的高度甲基化，主要富集在轉座子元件和其他類型的DNA重復序列上。散在分布轉座子相關的DNA甲基化同樣在真核生物染色體臂上存在。

在植物中，從頭DNA甲基化是由RNA指導的DNA甲基化通路（RdDM）所介導的，除了一系列的蛋白還涉及到了小干擾RNA（siRNA）和支架RNA（圖1）。根據目前對于擬南芥中經典的RdDM通路理解，24核苷酸siRNA的產生是由RNA聚合酶POL IV通過轉錄起始的，起始后由RNA依賴性的RNA聚合酶RDRP2（也叫RDR2）進行轉錄本拷貝以形成雙鏈的RNA（dsRNA），再由類DICER蛋白DCL3將dsRNA剪切成siRNA。這些siRNA會裝載到AGO蛋白上，主要是AGO4和AGO6，然后通過與支架RNA互補配對，這些支架RNA是由POL V. AGO4與DNA甲基轉移酶DRM2互作產生的，進而通過一種不依賴于序列的方式催化從頭甲基化。該反應可能由RDM1所協助，該蛋白可同時關聯AGO4和DRM2，還可能能夠結合單鏈的被甲基化的DNA（圖1）。

ReDM

RNA介導的DNA甲基化.jpg

除了siRNA和支架RNA之間序列特異性的配對外，AGO4和NRPE1及RDM之間的蛋白互作對于RdDM也是非常重要的。NRPE1是POL V最大的亞基，而RDM3是POL V相關的轉錄延伸因子。POL V轉錄的ncRNA肯定保留在染色質上，作為支架RNA發揮功能，這個過程可能受到了RRP6L1的促進，RRP6L1蛋白是酵母和哺乳動物核糖體RNA加工RRP6蛋白的同源物，主要作用于RNA保留。另外，IDP復合物能夠穩定siRNA與支架RNA之間的配對，IDP結合RNA，并與SWI/SNF染色質重塑復合物互作，該復合物主要包含SWI/SNF復合物亞基SWI3B，并參與POL V介導的核小體位置改變引起的轉錄沉默。

預先存在的染色質修飾可以促進招募POL IV和POL V到RdDM的靶向位點。POL IV由SHH1蛋白招募，該蛋白通過本身的Tudor結構域結合二甲基化的組蛋白H3賴氨酸9（H3K9me2）。SHH1還能夠與CLSY1互作，而CLSY1蛋白是與POL IV相關的染色質重塑蛋白，并且對于POL IV-依賴性的siRNA合成是必要的（圖1）。POL V與染色質之間的關聯生成支架RNA這個過程需要染色質重塑DDR復合物，主要由染色質重塑蛋白DRD1、染色體結構維持蛋白DMS3和RDM1構成（圖1）。DDR復合物物理上能夠與SUVH2和SUVH9互作，這兩個蛋白是屬于SU(VAR)3-9組蛋白甲基轉移酶家族蛋白的成員，但缺失足蛋白甲基轉移酶活性（圖1）。SUVH2和SUVH9通SRA結構域識別甲基化的胞嘧啶，對于POL V在全基因組范圍染色質上的正確分布是必需的，因此被認為通過預先存在的DNA甲基化來招募POL V。然而，通過鋅指將SUVH9栓到未甲基化的DNA上已經能夠招募POL V，并建立起DNA甲基化和基因沉默。

既然POL V能夠在同一位點產生帶有不同5?端的ncRNA，貌似起始轉錄的過程并不依賴于啟動子。全基因范圍的POL V或POL IV染色質分布圖譜并未發現一致的啟動子基序。一些POL V轉錄的ncRNA在5?端具有7-甲基鳥苷的帽子，顯示POL V產生的轉錄本可以適用于一些已知的用于修飾POL II轉錄的mRNA加工過程。然而，POL V產生的轉錄本在3?端缺少多聚腺苷酸，因此與mRNA不同。與POL V轉錄本足夠長能夠被常規的PCR檢測到不一樣，POL IV轉錄的ncRNA（P4 RNA）大多只有46-50個核苷酸，因此只有近期對擬南芥的dcl三突和四突植株采用小RNA深度測序檢測到了這一類ncRNA，這兩個突變體植株中POL IV依賴性和RDR2依賴性的dsRNA剪切成24核苷酸siRNA可能失效了。P4 RNA在dcl三突植株中積累，而且可以被外源的DCL3處理成24核苷酸siRNA。因為P4 RNA非常小，每一個24核苷酸siRNA都可能來自于一個P4 RNA前體的切割。

除了經典的POL IV–RDR2–DCL3通路產生24核苷酸siRNA，這些蛋白的旁系同源物同樣可以通過非典型RdDM通路產生siRNA（圖1）。POL II介導的轉錄不僅可以產生24核苷酸siRN和支架RNA，同時還能在某些RdDM靶向位點招募POL IV和POL V促進siRNA的產生。POL II與POL V相比，能夠與不同的AGO蛋白有空間上不同的聯系。在反式激活siRNA基因和一些轉錄激活轉座子區域中，相比于POL IV和RDR2，RdDM更加依賴于POL II和RDR6。由DCL2和DCL4產生的21核苷酸或22核苷酸或者由DCL2產生的24核苷酸可以影響RDR6依賴性RdDM。

擬南芥中的siRNA大多數是24核苷酸的，在dcl四突變體植株中幾乎完全消失；然而，RdDM靶區域大約三分之二的DNA甲基化仍然保留，表明存在不依賴于DCL的RdDM存在，可能由一些不依賴于DCL的siRNA或直接由P4 RNA所介導（圖1）。除了DCL蛋白外的RNase III酶能夠切割dsRNA，并且在野生型植株中，RNase III酶可能與DCL蛋白一同發揮作用，將POL II、POL IV或POL V轉錄本加工成siRNA。

遺傳篩選已經鑒定了一些mRNA前體剪切因子，這些因子突變掉會不同程度地降低POL IV依賴性siRNA的水平，而這些剪切因子是如何影響siRNA的水平暫時還不清楚。比如說，STABILIZED 1和RDM16這兩個剪切因子的突變會降低POL V依賴性支架RNA的積累。據推測，一些能夠結合mRNA前體的剪切因子可能會跟由POL IV和POL V產生的非編碼轉錄本結合，并影響它們的加工或是穩定性，進而影響siRNA或支架RNA的豐度。

Maintenance of DNA methylation

植物甲基化的維持取決于胞嘧啶序列的組成，由受到不同機制調控的DNA甲基化轉移酶催化（圖2）。CG胞嘧啶甲基化由MET1維持（圖2a）。MET1是哺乳動物DNA胞嘧啶-5-甲基轉移酶DNMT1的同源物，主要在DNA復制后識別半甲基化的CG二核苷酸，并且甲基化子鏈上未被修飾的胞嘧啶。與人類和老鼠的DNMT1相比，擬南芥的MET1缺少富含半胱氨酸的CXXC結構域，該結構域被認為有助于幫助DNMT1區分半甲基化CG和未甲基化CG。哺乳動物中，DNMT1由E3泛素蛋白連接酶UHRF1所招募，與此類似，植物中的MET1由VARIANT IN METHYLATION蛋白招募到DNA上，該蛋白是UHRF1的同源物，對于維持CG甲基化是必需的。

植物DNA甲基化的動態調節.jpg

CHH甲基化由DRM2或者CMT2所維持，取決于所處的基因組區域。DRM2維持RdDM靶向區域的CHH甲基化，這些區域主要集中在演化上比較年輕的轉座子、短轉座子以及一些常染色體臂上的其他重復序列，同時還有通常出現在異染色質區域的長轉座子的邊緣區域。相反，由CMT2催化的CHH甲基化主要在含組蛋白H1異染色質區域，而這些區域不存在RdDM。DDM1的突變會破壞由CMT2催化的CHH甲基化，DDM1是一種染色質重塑蛋白，該蛋白同時對于維持對稱胞嘧啶序列處的DNA甲基化也是必需的。非對稱甲基化的維持可能也會受到MET1和CMT3的影響，因為MET1依賴性的甲基化同樣可以被SUVH2和SUVH9所識別以在某些RdDM位點招募POL V，另外CMT3依賴性的CHG甲基化增加了H3K9me2的水平，進而促進了CMT2催化的非CG類型甲基化。盡管CHH胞嘧啶僅僅可以被DRM2和CMT2所甲基化，但這兩個酶也可以在其他序列類型上甲基化胞嘧啶。

Active DNA demethylation

0

缺少甲基化轉移酶活性或者DNA復制后缺少甲基供體會導致未能持續維持甲基化，也就是所謂的被動DNA去甲基化。DNA甲基化也可以通過酶的方式來擦除，也就是主動DNA去甲基化。與DNA甲基化反應受到單個DNA甲基化轉移酶所催化相反，主動DNA去甲基化需要一系列的酶來實現，而起始這個過程的酶就叫做DNA去甲基化酶。在植物中，一類具有雙功能的5-mC DNA糖基化酶-脫嘌呤/脫嘧啶裂解酶家族通過堿基切除修復途徑來起始主動DNA去甲基化（圖3a）。哺乳動物中的主動DNA去甲基化也涉及到一個DNA糖基化酶，同時也有剪輯切除修復機制參與其中。然而，植物DNA糖基化酶可以識別并直接移除5-mC堿基，而在哺乳動物中，5-mC必須先經過氧化，然后才能被DNA糖基化酶所催化、移除。

擬南芥雙功能5-mC糖基化酶基因家族有4個基因，分別是沉默抑制子ROS1、轉錄激活子DME、類DME蛋白DML2以及DML3，這些酶能夠識別所有序列類型的胞嘧啶并切除5-mC。ROS1、DML2和DML3在所有的營養器官中均有表達，而DME優先在雌雄配子的伴細胞中表達，也就是雌配子體的中央細胞和雄配子體的營養細胞。
在DNA去甲基化過程中，這些雙功能酶起先作為DNA糖基化酶水解堿基和脫氧核糖之間的糖基鍵，然后作為脫嘌呤或脫嘧啶裂解酶去切段DNA鏈，產生一個無堿基位點（圖3a）。5-mC堿基的切除跟隨著β-消除或β,δ-消除反應，會形成一個以3-磷-α,β-不飽和醛或3磷酸為結尾的缺口。隨后，脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶DNA-(無嘌呤或無嘧啶位點)裂解酶APE1L和DNA磷酸酶多聚核苷酸3?-磷酸酶ZDP在β-消除或β,δ-消除反應的下游發揮作用以生成一個3? OH基團，進而缺口能夠被DNA聚合酶和連接酶所填充（圖3a）。擬南芥DNA連接酶LIG1的亞細胞共定位與ROS1、ZDP和APE1L一致，且對于胚乳組織中母本印跡基因FWA和MEA的去甲基化和激活是必需的，這些證據顯示LIG1可能是主動DNA去甲基化通路中發揮作用的連接酶。

ROS1在體外能夠在特異性的靶位點上隨機滑動，但在細胞內，DNA去甲基化酶存在靶標特異性，主要取決于不同的染色質特性和招募的蛋白。由DME介導的去甲基化則偏愛常染色質區域小的、富含AT的轉座子，繼而導致鄰近基因表達量的改變。ROS1同樣靶向轉座子，進而傾向于在基因附近。這說明由ROS1介導的去甲基化有助于在轉座子和基因之間建立邊界，預防來自轉座子的DNA甲基化和轉錄沉默擴散。ROS1也部分作用于抵消由RdDM通路建立的DNA甲基化，盡管ROS1也去甲基化非RdDM依賴性的區域（圖3b）。對于RdDM中控制靶位點特異性的小RNA是否在ROS1靶向特定位點的過程中發揮作用還不清楚，盡管RNA結合蛋白ROS3對于一些ROS1依賴性基因組區域的去甲基化非常重要。ROS1靶向轉座子和其他一些富含乙酰化的H3K18和H3K27me3的基因組區域和一些沒有H3K27me和H3K9me2的基因組區域。

ROS1靶向某些基因組區域是由抗沉默蛋白復合物IDM所介導的，該復合物包含IDM1、IDM2、IDM3、MBD7、HDP1和HDP2（圖3a）。IDM2是一個含α-晶狀體結構域的蛋白，其能夠與IDM1發生互作，同時對于植物中IDM1依賴性的H3K18乙酰化是需要的。MBD7優先結合到高度甲基化的CG致密區域，物理上能夠與IDM2互作，同時也能夠與IDM2的同源物IDM3互作，而IDM3也能夠與IDM1發生互作，MBD7作用于防止基因被抑制和DNA超甲基化。盡管IDM復合物被認為能夠保證IDM1靶向甲基化的DNA位點，而IDM1催化的組蛋白乙酰化是如何招募ROS1來進行DNA去甲基化的仍然還不是很清楚。