首篇FFPE空間轉錄組文章小讀:
文獻名稱:?Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer. Immunity. 2022
背景介紹
????癌癥TLS中免疫浸潤的組成也稱為三級淋巴器官或異位淋巴結構，是出生后在非淋巴組織中出現的免疫細胞的有組織聚集體。TLSs在生理條件下不存在，但在慢性炎癥環境中形成。
TLS 結構
????利用多重熒光免疫組化技術（mIHC）評估腫瘤免疫微環境和TLS的成熟度。研究者認為，成熟的TLS（mTLS）由B細胞和CD23+ 濾泡樹突狀細胞（DCs）組成，與一個較小的CD4+和CD8+混合T細胞區相連。
????三級淋巴結構又叫免疫相關淋巴組織，包括粘膜相關淋巴組織、皮膚相關淋巴組織等，主要包括B細胞、濾泡樹突狀細胞、T細胞、成纖維網狀細胞、基質細胞、樹突細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和內皮細胞。濾泡狀樹突細胞通常位于B細胞中心，表達各類受體，促進抗原遞呈至B細胞，并驅動B細胞表達高活性的抗體。
TLS 形成?
? ? TLS存在于長期炎癥部位的附近，這樣的炎癥引發原因可以是免疫疾病、傳染病、器官移植、腫瘤、炎癥性疾病等。在腫瘤中，TLS通常在腫瘤浸潤部位產生。
????在TLS形成的過程中，首先是慢性炎癥部位附近的基質細胞或者淋巴細胞分泌趨化因子CXCL13或者IL-7，招募淋巴組織誘導因子至炎性部位；淋巴組織誘導因子表達LTα1β2，結合到位于基質細胞的LTβR受體上，促進基質細胞分泌VEGFC (vascular endothelial growth factor C)，介導HEV (high endothelial venule) 形成。
TLS 結構優勢
????為什么在慢性炎癥條件下在感染或癌癥部位創建淋巴生態位可能是有利的：
（1）速度：T和B細胞池的局部啟動可能導致更快的免疫反應，因為它規避了DC和淋巴細胞進出SLO的運輸。
（2）效率：局部淋巴生態位的產生可能會增加疾病相關抗原和稀有匹配淋巴細胞之間相遇的可能性，從而可能能夠誘導更強烈或更廣泛的免疫反應。
（3）控制：擁有與發炎組織部位直接接觸的淋巴生態位可能會提供額外的機會來引導免疫反應。
（4）存活：在一些TLS中存在大量功能失調的PD-1 high CD8+ T細胞，這是一種與優先腫瘤反應有關的表型，在該模型中，TLS不僅對誘導很重要，而且對維持免疫反應也很重要。
? ? TLS相關成纖維細胞和其他細胞亞群分泌的存活因子支持TLS中的淋巴細胞穩態，可能有助于腫瘤反應性T細胞在腫瘤部位的長期持續存在。
研究過程
????利用空間轉錄組, 免疫組學, Bulk BCR測序 等技術, 解讀腎細胞癌組織中TLS結構與患者生存率的關系, 揭示TLS中B細胞的克隆類型, 推測并驗證漿細胞隨成纖維細胞轉移至病灶區域, 呈現抗體與巨噬細胞共同完成癌細胞的消殺過程; 最終定義成熟的TLS結構與意義;
空間TME揭示TLS+相關區域富含B細胞
1. 使用冷凍（n = 12）和 FFPE 切片（n = 12）對 24 個 ccRCC 原發性腫瘤進行空間轉錄組學。在對切片進行 H&E 染色后，經驗豐富的病理學家 (VV) 對每個腫瘤的整體組織以及 TLS 的存在和定位進行了注釋。A: TLS+ 冷凍切片腫瘤、B: TLS+ FFPE 腫瘤、C: TLS- 冷凍切片腫瘤。
2. TLS+ 腫瘤中，B 細胞譜系（包含識別從幼稚細胞到 PC 的所有成熟步驟的基因）和 T 細胞（識別不同的 T 細胞群）基因特征優先在位于TLS 區域中表達 。這些腫瘤表現出 CD8 T 細胞特征的低表達，在 TLS 區域略有富集（p = 0.017）。TLS 中的單核細胞譜系特征略高（分別為 p = 0.00081 和 p = 0.035），而 NK 細胞更廣泛地分布在整個腫瘤切片中。內皮細胞和中性粒細胞均勻分布，在 TLS 內得分較低），而在 TLS 區域發現成纖維細胞特征的高表達。
3. TLS 與 B 譜系、T 細胞和成纖維細胞特征的表達有關。
4. Ca9是ccRCC腫瘤細胞的標志物；
TLS 內外差異基因差異分析鎖定差異: 免疫球蛋白+B細胞
1. 三重免疫熒光（IF） 標記 (CD20/CD3/PD-1) 確認 H&E 定義的 TLS 位置；
2. 9/10 的 TLS+ 腫瘤中 AUC 范圍為 0.75 至 0.93 ；1/10樣本的 AUC 為 0.62 且 TLS 印記特征表達較弱(該腫瘤缺乏 TLS 成熟度標志物，例如 CD23 和 BCL6，以及外周淋巴結尋址素陽性 (PNAd+) 高內皮小靜脈 (HEV));
3.? TLS imprint 標志物: 對TLS內部區域和外部區域進行了差異基因表達分析（logFC>1, p.adjust <0.05，不同樣本存在overlap)，獲得?TLS imprint 的標志物: 12 個免疫球蛋白基因、5 個 B 細胞標志物， 2 個 T 細胞標志物、2 個成纖維細胞標志物、2 個補體蛋白編碼基因，以及 CD52、APOE、PTLP、PTGDS、PIM2 和 DERL3 基因。
Ig 和 B 細胞相關基因在 TLS 區域顯著富集促使研究關注 B 細胞
1. 精確定位與 TLS 相關的轉錄不同的 B 細胞亞型: 通過 RCTD 對單細胞分析中定義的 B 細胞亞群進行空間映射；
2. PC （漿細胞）相關基因 MZB1 （漿母細胞特征基因）的表達在 TLS 中高，而在冷凍切片腫瘤區域中總體低。
3. 由于漿母細胞不僅限于 TLS 區域，在 TLS 外發現 MZB1 的高表達: MZB1 的 PC 可能不僅存在于 TLS 中，而且存在于腫瘤區域；
4. 由于 PC 的主要功能是產生抗體，分析了免疫球蛋白基因的空間表達：IGHM 幾乎只在 TLS 區域表達，增強了 TLS 內非轉換 B 細胞的存在； IGHG1、IGHA1 和 pan Ig（IGKC 和 JCHAIN 的幾何平均值）基因在 TLS 區域以及遠端區域高度表達。 IGHG1 和 IGHA1 的分散表達表明同種型轉換的 PC 已在 TLS 中形成并在遠處遷移。
5. 成纖維細胞標記 COL1A1 的高表達;
6. CXCL12 （趨化因子, 與位于骨髓、淋巴結和慢性炎癥組織中的 PC 遷移和滯留有關）的表達與 MZB1 的表達共定位。
空間 BCR 識別原位超突變和克隆選擇
A. TLS區域也發現了數量最多的獨特輕鏈克隆型;
B. TLS區域VL基因突變少于或等于中位數; 與TLS相距較遠的腫瘤區域大多高突變;
C.? TLS區域和腫瘤區域VL突變計數統計;
D. 統計47例ccRCC樣本輕鏈和重鏈突變計數; TLS高, 體細胞突變(VL,VH)水平顯著較高;
體細胞超突變是否伴隨著克隆型選擇?
E. TLS高->總克隆型數目多+超過100倍的克隆型計數比例較高;
BCR克隆類型與空間分布
F. CDR3 序列構建進化樹:
點的大小表示每個克隆型的計數數量，點的顏色表示克隆型所在的不同空間點的數量;
√ found in both spatial and bulk analyses from the same tumor;
G. 同一家族的克隆型聚集在TLS附近聚集; 在遠離TLS區域稀疏分布;
漿細胞從TLS沿成纖維細胞軌道傳播
備注:?CD20: B淋巴細胞抗原; CD3: T細胞的共同的表面標志; MUM1: 表達于正常的漿細胞、晚期B細胞和活化的T細胞;? ? IgG/IgA: 血漿B細胞產生和釋放的一種抗體;COL1: 成纖維細胞標記;? ? CXCL12: 與位于骨髓、淋巴結髓索和慢性炎癥組織中的 PC(plasma cell) 生態位中的 PC 遷移和滯留有關;
????為了分析腫瘤內PCs和成纖維細胞的位置以及CXCL12的原位表達，使用多重IF標記FFPE腫瘤切片，利用多發性骨髓瘤癌基因（MUM1）作為PCs和成纖維細胞COL1（Col1a）的特異性標記。
? ? 通過連續玻片上的顯色CD3/CD20標記，在TLS區域內檢測到雙陽性MUM1+IgG+PC和少量MUM1+IgA+PC(4A);
? ? COL1+/CXCL12+成纖維細胞與MUM1+ PC并列(B);
? ? COL1+/CXCL12+成纖維細胞與MUM1+ PC并列(C);
? ? PC沿著纖維母細胞軌道排列，嵌入COL1+CXCL12+成纖維細胞的密集網絡中;
PC與COL1+成纖維細胞軌跡圖
1. 絕大多數PC與成纖維細胞非常接近，兩種腫瘤的平均距離分別為17.5和19 mm，圖G和K顯示了距離分布;
2. 44個腫瘤樣本的平均距離為25.7 mm;
3. Ig和成纖維細胞轉錄物的共同表達，以及成纖維細胞轉錄物和CXCL12的共同表達（圖2E）;驗證了PCs在TLS內以及沿空間轉錄組學確定的成纖維網狀細胞（FRC）軌跡的位置。引人注目的是，在被MUM1+IgG+成纖維細胞軌道包圍的腫瘤巢中檢測到與腫瘤細胞結合的IgG（圖4F和4J）。
產生Ig的PC與結合到凋亡腫瘤細胞上的IgG抗體與機體對免疫治療的反應相關
備注:?CD20: B淋巴細胞抗原; CD3: T細胞的共同的表面標志; MUM1: 表達于正常的漿細胞、晚期B細胞和活化的T細胞;? ? IgG/IgA: 血漿B細胞產生和釋放的一種抗體;? ? CD23是人類B淋巴細胞表面的一種分化抗原; PNAd: 抗體;? Bcl-6是一種編碼原癌基因蛋白，具有誘導細胞凋亡功能。Bcl-6主要表達在正常生發中心B細胞以及相關淋巴瘤中;
B：成熟TLS的特征是含有GC B細胞區，B細胞區被T細胞區包圍，其中存在CD4+ PD1+ T細胞、CD4+ PD1+ CXCR5+ Tfh細胞和CXCL13+ 細胞;
C: GC區的特征是在外圍檢測到CD23+濾泡樹突狀細胞（FDC）、BCL6+CD20+B細胞和PNAd+ HEV網絡;
D: TLS的存在與MUM1+ IgG+細胞密度和MUM1+IgA細胞密度之間存在顯著相關性;
E: 含有CD23+ FDC網絡的TLS、BCL6+細胞和PNAd+ HEV與MUM1+ IgG+ PC和MUM1+ IgA+ PC密度之間存在很強的相關性;
成熟TLS的特征
A. CAIX 是一種跨膜蛋白，在發育中的侵襲性腫瘤組織中過度表達，負責調節細胞內外的pH平衡; 黃色虛線方框和箭頭表示雙陽性細胞。
B.? 根據TLS狀態，IgG+（左）和IgA+（右）腫瘤細胞的百分比（n=103）。
C. 根據MUM1+IgG+PC的密度，IgG+腫瘤細胞的百分比（n=103）。
D. 根據MUM1+IgA+PC的密度，IgA+腫瘤細胞的百分比（n=103）。
E. caspase-3（綠色）染色顯示腫瘤細胞發生凋亡。
G. CD68+巨噬細胞與IgG+裂解的caspase-3+腫瘤細胞的共定位。
凋亡細胞數量多且IgG染色腫瘤細胞百分比高的腫瘤更容易被CD68+巨噬細胞浸潤;
與低IgG腫瘤細胞患者相比，高IgG腫瘤細胞患者的PFS要長得多;
內容概述
????針對ccRCC原發性腫瘤，作者做了12個冷凍切片空間轉錄組和12個FFPE切片空間轉錄組并結合BCR分析、多色免疫熒光等分析，發現腫瘤中的三級淋巴結構產生成熟B細胞，漿細胞擴散到腫瘤基部中，產生抗體與腫瘤細胞結合并引發其凋亡。
? ? B細胞在TLS中富集。BCR分析顯示TLS中的克隆多樣性、選擇、擴展，以及遠處存在完全成熟的克隆型。
? ? 在TLS+腫瘤中，產生IgG和IgA的PC沿著成纖維細胞的軌跡播散到腫瘤區域。
? ? TLS+樣本具有高豐度IgG的PC和凋亡的惡性腫瘤細胞，提示具有抗腫瘤效應物活性。
? ? 在接受免疫檢查點抑制劑治療的RCC患者中，治療反應和無進展生存率與IgG染色的腫瘤細胞相關。
? ? 結論: 腫瘤內TLS維持B細胞成熟和抗體產生，這與免疫治療反應相關，可能通過直接抗腫瘤作用實現。
參考文獻:?
Maxime Meylan, Florent Petitprez, et al. Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer. Immunity.?
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