Trends Biotechnol | 單細胞分析循環腫瘤細胞

原創?huacishu?圖靈基因?2022-08-30 11:43?發表于江蘇

收錄于合集#前沿生物大數據分析

撰文：huacishu

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1、作者概述了用于CTC單細胞分離和分析的尖端技術；

2、作者還強調了使用單細胞分析平臺進行癌癥管理的CTC的生物學特征、臨床應用和治療潛力。

澳大利亞悉尼科技大學Majid Ebrahimi Warkiani教授課題組在國際知名期刊Trends Biotechnol在線發表題為“Single-cell analysis of circulating tumour cells: enabling technologies and clinical applications”的論文。循環腫瘤細胞（CTC）的多模式分析有可能為癌癥的發展和轉移提供新的見解。本文中，作者概述了用于CTC單細胞分離和分析的尖端技術。此外，作者還強調了使用單細胞分析平臺進行癌癥管理的CTC的生物學特征、臨床應用和治療潛力。

分析CTC的重要性

近年來，對驅動腫瘤進展和轉移的分子變化的理解有所提高，這使實體瘤的臨床治療朝著更加個性化的方向發展。確定癌癥發生和發展的基因組驅動因素有助于新一代治療劑的臨床開發，稱為靶向治療。這些藥物通常靶向控制癌細胞增殖和其他生存機制的基因產物。然而，這些靶向治療常常通過癌基因突變或旁路信號通路的激活而導致治療抵抗。由于腫瘤的大小和位置因素，使用組織活檢通常是不可能的。

另一種方法涉及分析CTC，包括單個細胞和細胞簇。CTC是指從原發性或轉移性腫瘤中釋放的血液循環中的癌細胞群（圖1）。對CTC進行的全基因組單細胞RNA測序（RNA-seq）和DNA測序為實體腫瘤患者的CTC異質性和靶向治療耐藥機制提供了新的見解。在這篇文章中，作者描述了單細胞分析技術的最新進展，全面討論了分析單個和集群CTC的每種方法的優缺點。此外，還強調了單個CTC和CTC聚類分析在監測癌癥患者對個性化藥物的靶向治療反應中的臨床應用。

CTC的細胞和分子特征

CTC之間的表型變異表明存在特定的CTC亞群，這種變異可能賦予不同的轉移潛能。許多研究已經發現上皮-間充質轉化（EMT）與各種癌癥中獲得干細胞特性之間的聯系。除此之外，一些研究還通過在各種類型癌癥的單個和聚集的CTC上檢測到的免疫檢查點蛋白程序性死亡配體1（PD-L1）的表達，強調了CTC在免疫逃逸機制中的作用。

血液中CTC的數量取決于不同的因素，如癌癥類型和疾病狀態。然而，每107個白細胞的CTC計數通常在1到100之間。雖然檢測CTC由于其罕見性而具有挑戰性，但可以利用表型和生物學屬性來富集并最終在其他外周血細胞中分離CTC。

利用CTC基因組分析腫瘤異質性

CTC計數具有預后價值，捕獲的CTC的分子特征和功能測試可以更好地了解疾病狀態和潛在的治療方案。最近對單個CTC的研究發現了CTC對治療反應的克隆和動態進化的關鍵見解。CTC的存在或不存在可進一步用于揭示在腫瘤和轉移演變過程中激活或改變的分子途徑。

CTC單細胞分離技術

雖然傳統上通過常規成像分析CTC，允許使用少量標記物進行CTC計數，但富集和單細胞分離技術的出現使CTC的下游分析具有更深入的特征，這提供了原發腫瘤的關鍵信息。然而，富集樣品中CTC的低回收率和背景細胞的高污染常常給CTC的分子和功能表征帶來技術困難。因此，使用單細胞分析技術可以增強CTC的分析，并可以確定CTC作為癌癥生物標志物的潛在臨床應用（圖2）。

有限稀釋

有限稀釋，也稱為連續稀釋，是一種簡單且經濟有效的方法。該方法可以使用普通手持吸管或移液器實現，因此是一種低成本方法。但鑒于這些細胞稀少，這種方法不太利于在單細胞水平上分離CTC。還應注意的是，現代高通量單細胞基因組學儀器，如液滴和納米孔系統，使用有限稀釋來最小化細胞包封期間的倍增率。

微量取樣和操作

從富集樣品中手動分離單個CTC的另一種方法是使用超薄玻璃毛細管制成的微量移液管。在顯微鏡下分析富集的樣品，并且通常基于熒光標記和形態學來識別感興趣的細胞。通過手動微量移液進行單細胞分離的主要缺點是效率低、勞動強度大以及對操作員技能的依賴性。

為了克服這些限制，開發了商業化產品，以在短時間內實現細胞檢測過程的自動化（圖3）。盡管自動微操作器具有基于細胞形態和生物標記物以無人工和非侵入性方式識別、分離和轉移細胞的優勢，但該方法在處理粘附細胞時仍存在高成本、系統復雜性和低轉移效率的問題。

激光捕獲顯微切割技術

激光捕獲顯微切割（LCM）是一種組織捕獲技術，用于從大部分固體組織切片中分離單個細胞。該技術也被用于將靶細胞固定在載玻片上從富集樣品中分離CTC。使用高度精確的靶回收分離細胞，然后將其轉移到管或孔中用于各種分析，包括基因組學和轉錄組學分析。LCM是勞動密集型、耗時的，并且在處理懸浮細胞時需要固定樣品。

熒光激活細胞分選

熒光激活細胞分選（FACS）是一種高通量流式細胞技術，能夠通過熒光標簽來表征、檢測和分離細胞，并可以使帶靜電的液滴（包含細胞）通過高壓電場來分選細胞。FACS技術允許將含有單個細胞的納升級別的液滴分離和沉積到孔板中。然而，由于系統穩定和染色的樣本不足，以及無法分離具有低表達目標蛋白的細胞，FACS在處理低樣本量（例如富集的CTC樣本）時可能受到限制。

液滴生成器

液滴生成器利用微流體的能力精確處理微小體積的液體（圖2）。除了高通量基因組分析外，還可以通過合并、分類和分裂來操縱液滴，以測試液滴大小、pH值、變形和行為。基于液滴的分離在研究CTC的代謝活性方面具有潛在的應用。盡管液滴生成器具有高吞吐量，但由于系統穩定時間和低捕獲率，在處理低樣本輸入時，可能導致高細胞損失。此外，液滴生成器具有較高的設置和運行成本，需要專業技術來操作，這可能限制這些裝置的可訪問性。

納（微）孔

與液滴系統類似，通過將單個細胞與用于下游分析的條形碼捕獲珠配對來操作納米孔。這種方法導致許多孔不包含細胞，因此具有多個細胞的孔的風險降低，但由于每個孔包含磁珠，因此保留了高細胞捕獲率。一般來說，納米孔操作簡單，成本低，并允許并行化；然而，這些技術經常遭受交叉污染，并且不完全適用于運行有限的樣本，包括CTC和其他稀有細胞。

集成流體電路

集成流體電路利用氣動膜閥，通過空氣加壓，以偏轉彈性體并控制微米尺寸通道內的流體運動。在這種技術中，細胞通常被封裝在微室中，在微室內進行分析（圖2）。然而，這些系統通常在吞吐量方面受到限制，并且具有高復雜性。

介電電泳與光流體學

介電電泳（DEP）是一種由于不均勻電場而對介電顆粒施加力的現象。DEP通過微流體和微電子的結合，利用電動原理來操縱單個細胞。類似地，基于光流體的隔離方法將光學和微流體相結合，以精確操縱顆粒和細胞。這些設備提供了對細胞處理的高水平控制，在陣列中有效地用于隔離單個細胞，并已證明適用于CTC研究。然而，高成本是DEP和基于光流體隔離裝置的臨床適用性的主要缺點。

CTC單細胞分離的障礙

雖然可以利用CTC的物理和生物學特性的差異將其從血液中分離出來，但目前沒有單一的方法可以確保在一個設備中捕獲來自各種癌癥類型的所有CTC。例如，并非所有的CTC都比它們的非癌對應物大，也并非所有CTC都表達與血液中正常發現的細胞不同的細胞表面標記物（圖4A，B）。

CTC單細胞分析在腫瘤靶向治療中的臨床應用

個性化癌癥治療旨在根據腫瘤的個性化基因組圖譜治療患者。通過單細胞分析考慮腫瘤克隆進化研究，識別這些突變可用于監測治療壓力下的腫瘤進化軌跡，并允許給予適當的治療方案。單細胞分辨率下CTC的分子特征可以幫助識別和分析腫瘤微環境（TME）中的耐藥克隆。

迄今為止，大多數評估CTC基因組異常的臨床研究強調了可能改變靶向治療效果的基因突變的存在，包括但不限于EGFR、KRAS、HER2、PIK3CA、ALK和ROS1中的突變、重排或擴增。例如，使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKI）靶向突變的EGFR可提高NSCLC患者的存活率。許多研究報告了在捕獲的CTC中檢測到的突變。

由于KRAS突變的CTC可以逃避EGFR-TKI治療，因此使用CTC持續監測KRAS的突變狀態可能有助于早期檢測對EGFR-T KI產生的耐藥性。在原發性和轉移性乳腺癌中，PIK3CA突變已被引入為HER2靶向治療的主要分子耐藥機制之一。此外，據報道，乳腺癌和前列腺癌患者的耐藥發展與CTC中間充質標志物的表達呈正相關。綜上所述，這些臨床前和臨床發現突出了單細胞CTC基因改變分析的預測能力，以及此類分析在靶向治療期間顯示干細胞表型的CTC縱向研究中的益處。

結論和未來展望

CTC計數研究一直顯示CTC數量與疾病結果之間存在聯系。CTC計數被認為是一種強有力的預后手段，表征CTC的單細胞技術提供了有關轉移和治療抗性機制的細節。這使我們對CTC異質性和潛在的原發腫瘤有了獨特的認識。現代單細胞基因組學方法提供的特征提供了患者腫瘤的細節，超出了傳統的基于圖像的CTC計數。

由于癌癥是一種復雜的疾病，通常由涉及多個基因改變的多個因素引起，因此真正了解癌癥范圍內CTC和CTC簇的臨床相關性并非易事。這將涉及在不同治療條件下對許多疾病處于不同階段的患者進行的廣泛研究。加速該過程的一種方法是開發可與高分辨率分子分析工具結合的高效分離方法。盡管存在缺點，但毫無疑問，基因組分析能夠并且已經提供了更深入的CTC特征。臨床研究表明，這可能會提高個性化靶向治療的患者分層能力。

進一步了解CTC和CTC簇如何與癌癥進展和治療選擇相關的另一種方法是生成用于分子分析和藥物篩選的CTC細胞系和CTC衍生異種移植物（CDX）。然而，細胞系的體外擴增或從CTC產生CDX預計會對分離的CTC施加選擇性壓力，導致潛在變化。此外，不可能建立一個平臺來長期研究CTC簇的免疫成分，因為CTC簇在增加轉移潛能方面起著關鍵作用。因此，雖然在確定CTC的合適生長培養基后，CTC擴增可能是合適的解決方案，但這些藥物篩選試驗通常需要大量時間/成本，并且可能不會對每個患者進行CTC擴增。

通過將CTC的高分辨率單細胞分子表征結果與藥物篩選相結合，有可能將CTC和CTC簇的表型和基因組圖譜連接起來，以確定固有的藥物敏感性。如果藥物敏感性與CTC和CTC簇的分子和表型特征密切相關，就有可能找出針對個別患者的最佳治療方法，并隨著疾病的進展進一步改變治療方法。

因此，為了實現臨床環境中CTC分析的集成，富集平臺需要；（i）?操作簡單且具有成本效益，（ii）適用于廣泛的癌癥，（iii）允許在誘導任何生物變化之前快速分離CTC和CTC簇，以及（iv）可以與當前新興的下游高維分子分析兼容格式結合。綜上所述，作者認為，CTC分離的技術改進、利用空間轉錄組學和蛋白質組學等最新技術對富集的CTC進行功能分析，以及體外擴增CTC用于藥物敏感性測試，是突出CTC分析作為臨床實踐中潛在的癌癥診斷和預后生物標志物的關鍵。

教授介紹

Majid E.Warkiani博士是澳大利亞悉尼UTS生物醫學工程學院的教授。他獲得了南洋理工大學（NTU）的機械工程博士學位，并在麻省理工學院（SMART Center）接受博士后培訓。他是NHMRC-CD研究員，也是UTS生物醫學材料和設備研究所（IBMD）和健康技術中心（CHT）的成員。他還是澳大利亞-中國護理點測試聯合研究中心的組長和聯合主任。他因其卓越的研究成果獲得了多項獎項的認可，包括麻省理工學院技術評論35歲以下創新者獎（2016年）和南洋青年校友獎（2017年）。

Warkiani教授目前的研究活動集中在以下三個關鍵領域：（i）微流體，涉及設計和開發用于診斷和治療應用的粒子和細胞分選（例如循環腫瘤細胞、胎兒細胞和干細胞）的新型微流體系統，（ii）芯片上器官，涉及新型3D芯片上實驗室系統（例如，芯片上肺、芯片上腫瘤）的制造和表征，以模擬組織和器官的生理功能；以及（iii）3D微打印，涉及設計和開發用于基礎和應用研究的新型微型系統（例如微型混合器、微型旋風器）。Warkiani是慣性微流體的先驅之一，他在理論和新應用方面為推進該領域做出了重大貢獻。Warkiani的研究愿景是將3D微打印和微流體技術的進步結合起來，為醫療和生物技術部門量身定制成本效益高的細胞分選技術。Warkiani發明并展示了多種用于診斷和治療目的的癌細胞分離、干細胞純化的平臺技術。這些平臺目前正由澳大利亞、新加坡和美國的公司進行商業化。

參考文獻

Radfar P, Aboulkheyr Es H, Salomon R, et al. Single-cell analysis of circulating tumour cells: enabling technologies and clinical applications. Trends Biotechnol. 2022;40(9):1041-1060. doi:10.1016/j.tibtech.2022.02.004.