The combined signatures of hypoxia and cellular landscape provides a prognostic and therapeutic biomarker in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma

缺氧和細胞景觀的組合特征為乙型肝炎病毒相關(guān)肝細胞癌提供了預后和治療性生物標志物

發(fā)表期刊：Int J Cancer

發(fā)表日期：2022 Apr 25

doi:10.1002/ijc.34045

一、背景

????????肝細胞癌（HCC）是世界上第四大癌癥死亡原因，也占所有原發(fā)性肝臟惡性腫瘤的85%以上。盡管有國家疫苗計劃和抗病毒療法，乙肝病毒（HBV）感染估計影響全球2.92億人，仍然是HCC的最大原因之一HBV在重塑肝臟腫瘤微環(huán)境（TME）方面起著關(guān)鍵作用，包括免疫和非免疫細胞群。鑒于TME內(nèi)各種細胞的存在被證明對抗腫瘤免疫反應至關(guān)重要。許多非免疫細胞如TME中的基質(zhì)細胞也與癌細胞相互作用，直接或間接地促進或抑制腫瘤的生長和擴散。

? ? ? ?缺氧作為HCC中血管生成、轉(zhuǎn)移和代謝改變的不利決定因素，低氧誘導因子1（HIF-1）的過度表達與預后不良密切相關(guān)。除了對腫瘤細胞的影響外，缺氧確實使TME中的一些事件發(fā)生，并影響到許多TME周圍的細胞，這些細胞在腫瘤發(fā)生過程中起著至關(guān)重要的作用，從而促進了腫瘤的侵襲性和對抗腫瘤反應的抑制。

二、材料與方法

1.數(shù)據(jù)來源

臨床信息完整且HBV感染陽性的患者（n = 596）被納入本研究

(1)包括四個隊列的452個HBV-HCC腫瘤（GSE14520、GSE10143、ICGC-LIRI-JP和Gao等人）和另一個來自TCGA-LIHC的144個HBV-HCC腫瘤作為獨立的驗證隊列

(2)從GSE125449收集了9個HCC腫瘤的單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和細胞注釋

(3)3個HCV-HCC隊列，以及32個泛癌隊列

(4)從GEO數(shù)據(jù)庫中招募了一組67例接受索拉非尼治療的HCC患者（GSE109211）和一組65例接受MAGE-A3免疫治療的黑色素瘤患者（GSE35640）

2.實驗流程

(1)缺氧相關(guān)基因和TME細胞定量：KEGG數(shù)據(jù)庫（途徑“hsa04066”）獲得了構(gòu)成HIF-1信號通路的109個缺氧相關(guān)基因，從上述所有隊列中提取所有缺氧相關(guān)基因的表達。利用xCell計算的富集評分來表示所有隊列的每個腫瘤樣本中每種TME細胞類型的豐度。

(2)預后缺氧相關(guān)基因和TME細胞的鑒定：缺氧相關(guān)基因和TME細胞的預后評估是通過四個不同隊列中每個隊列的Cox比例風險回歸分析確定。

流程圖

三、實驗結(jié)果

01 - 對四個不同HBV-HCC隊列的薈萃分析揭示了缺氧和TME的預后價值

????????作者共招募了596個HBV-HCC腫瘤，包括四個隊列（GSE14520, ICGC-LIRI-JP, GSE10143, Gao et al, n = 452）和一個獨立的驗證隊列（TCGA-CIHC, n = 144）。對于所有患者，在四個不同的隊列中分別獨立分析了109個缺氧相關(guān)基因和64個TME細胞類型的預后價值，然后使用薈萃分析來整合每個缺氧相關(guān)基因和TME細胞的總體預后評估。最終，基于452份HBV-HCC腫瘤樣本，將48個缺氧相關(guān)基因和19個TME細胞鑒定為獨立預后因子。這些預后基因/TME細胞及其相應的亞群（根據(jù)其基因功能或細胞類型進行分組）顯示在一個網(wǎng)絡中（圖S1）。其中，大多數(shù)選定的缺氧相關(guān)基因在預后不利。值得注意的是，所有功能與減少耗氧量有關(guān)的基因都是不利因素，例如包括HK2、LDHA、PGK1、ALDOA等（圖S1）。對于選定的TME細胞，12/19是預后有利的細胞，包括CD8+效應記憶T細胞、B細胞、漿細胞、NK細胞等。其余7個預后不利的細胞包括γδT細胞（Tgd）、嗜堿細胞、肥大細胞等（圖S1）。

圖S1????部分預后良好的TME細胞和缺氧相關(guān)基因及其相應的細胞類型和基因功能

????????隨后分別根據(jù)預后缺氧和TME特征，將缺氧和TME特征考慮在內(nèi)，制定了缺氧評分和TME評分。根據(jù)每個隊列中缺氧評分和TME評分的平均值，將腫瘤分為兩個亞組。值得注意的是，缺氧評分與預后不利的缺氧相關(guān)基因緊密正相關(guān)，與預后有利的基因負相關(guān)（圖2A）。而對于TME評分，觀察到TME評分與預后有利的TME細胞之間有強烈的正相關(guān)，與預后不利的TME細胞之間有負相關(guān)（圖2B）。此外，與低氧評分和低TME評分的患者相比，低氧評分和高TME評分的患者在統(tǒng)計學上的生存期更長（圖2C，D）。而缺氧評分高的腫瘤，其HIF-1通路的基因明顯富集（圖2E）。同樣，TME得分高的腫瘤在免疫反應途徑上也有富集（圖2F）。為了進一步驗證肝癌單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜中的缺氧和TME分數(shù)，作者對9名患者的肝癌生物樣本的單細胞數(shù)據(jù)進行了t分布的隨機鄰接嵌入（t-SNE）分析（圖2G），并分別計算出缺氧和TME分數(shù)。據(jù)觀察，惡性細胞和基質(zhì)細胞表現(xiàn)出比免疫細胞更高的缺氧分數(shù)（圖2H，J）。而免疫細胞如單核細胞/巨噬細胞、CD8 T細胞和漿細胞的TME得分高于任何其他基質(zhì)成纖維細胞、惡性細胞或內(nèi)皮細胞（圖2I,K）。

圖2????分別根據(jù)缺氧相關(guān)基因和TME細胞制定缺氧評分和TME評分

02 - 已建立的缺氧-TME分類器的預后價值

????????基于上述結(jié)果，作者考慮是否有可能將缺氧評分和TME評分結(jié)合起來，來描述缺氧性TME的特征。由于不僅在大多數(shù)HBV-HCC隊列中發(fā)現(xiàn)缺氧評分和TME評分之間存在統(tǒng)計學意義上的負相關(guān)，而且在所有32個泛癌隊列中也發(fā)現(xiàn)了這種負相關(guān)。因此，將缺氧評分與TME評分相結(jié)合，建立了缺氧-TME分類器，從而將患者分為四個亞組：缺氧低/TME高，缺氧低/TME低，缺氧高/TME高，缺氧高/TME低。低氧-TME分類器在HBV-HCC隊列（n = 452）中顯示了統(tǒng)計學上的不同預后（圖3A）。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧評分和TME評分都對預后價值有很大貢獻。與其他三個亞組的患者相比，低氧/TME高亞組的患者具有最好的預后。缺氧低/TME低和缺氧高/TME高亞組患者的預后差異較小，在兩個最大的隊列中，缺氧低/TME低和缺氧高/TME高亞組不同疾病階段的比例非常相似。因此，將這兩個亞組合并為一個混合組。重要的是，缺氧-TME分類器的性能在另一個獨立的HBV-HCC隊列（n = 144）（圖3B）、HCV-HCC隊列（n = 270）和各種HCC患者（n = 1294）中得到進一步驗證。此外分別基于三個亞組的缺氧-TME因子（缺氧相關(guān)基因和TME細胞）的綜合內(nèi)部和組間相關(guān)性生成了相關(guān)系數(shù)熱圖。在缺氧低/TME高和缺氧高/TME低亞組中出現(xiàn)了內(nèi)部正相關(guān)和組間負相關(guān)的特點（圖3C）。

圖3????基于缺氧-TME分類器的預后價值和腫瘤細胞信號通路分析

????????為了描述缺氧-TME分類器的詳細預后價值，對所有5個HBV-HCC隊列和3個HCV-HCC隊列分別進行了單變量和多變量Cox回歸分析。在有足夠患者的訓練隊列和一個驗證HBV-HCC隊列中，缺氧-TME分類器與總生存期顯著相關(guān)（圖3D）。另外，該分類器在三個HCV-HCC隊列中的一個隊列中顯示了統(tǒng)計學意義上的預后價值（圖3E）。同樣，缺氧-TME分類器的預后價值可以在10/32個泛癌隊列中得到驗證。

03 - 不同缺氧-TME亞組之間的細胞信號通路的差異

????????考慮到基于缺氧-TME分類器的明顯預后差異，在有足夠基因進行通路分析的三個隊列中，根據(jù)缺氧-TME亞組進行了腫瘤內(nèi)細胞信號通路分析（圖3F）。亞組中的腫瘤在腫瘤增殖和癌癥代謝相關(guān)基因表達方面表現(xiàn)出不同的模式。與缺氧分數(shù)高的腫瘤相比，缺氧分數(shù)高的亞組中的腫瘤顯示出氨基酸代謝、脂肪酸代謝、碳代謝和ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運體相關(guān)基因表達的富集程度要高得多。此外，低TME評分亞組的腫瘤顯示出比高TME評分的腫瘤更高的DNA復制、錯配修復、細胞周期和RNA轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達的豐富度。以上進一步證明了缺氧和TME對腫瘤代謝和癌細胞增殖的協(xié)同影響，這意味著對缺氧-TME進行綜合分析的意義。

????????此外，作者還構(gòu)建了蛋白圖，以更好地顯示缺氧低/TME高和缺氧高/TME低亞組之間的細胞信號通路差異。缺氧低/TME高組的腫瘤顯示出補體級聯(lián)和PPAR相關(guān)蛋白的較高富集度，這些蛋白在增強宿主免疫反應中發(fā)揮著重要作用。而缺氧高/TME低亞組的腫瘤顯示出較高的細胞周期、DNA復制和轉(zhuǎn)錄因子的富集（圖S9）。上述結(jié)果進一步說明了腫瘤微環(huán)境中缺氧評分（缺氧狀態(tài)）和TME評分（免疫反應）的生理意義，這可能有助于闡明基于腫瘤生物學的不同亞組的預后差異。

圖S9????功能分析

04? 缺氧-TME分類器與臨床特征和其他HCC相關(guān)分子分類特征之間的聯(lián)系

????????作者接下來研究了基于缺氧-TME分類器的臨床特征和其他HCC相關(guān)特征。與其他亞組相比，在缺氧高/TME低亞組中發(fā)現(xiàn)晚期HCC患者和腫瘤較大的患者略多。然而，AFP、多結(jié)節(jié)和肝硬化在不同的缺氧-TME亞組中并無差異（圖4A，上欄）。為了進一步將缺氧-TME分類器與之前記載的其他HCC相關(guān)的分子分類簽名進行比較，盡可能全面地分析了之前的HCC相關(guān)分子分類簽名。熱圖顯示，在預測HCC的預后方面，缺氧-TME分類器與來自24個不同研究的57個基因組簽名非常一致（圖4A）。缺氧低/TME高亞組的患者顯示出不利于預后的相關(guān)特征的低富集，而這些特征在缺氧高/TME低亞組的患者中高度富集。同樣，在缺氧低/TME高亞組中有利的預后特征大大豐富，而在缺氧低高TME低亞組中表達較少。混合亞組也顯示了這些特征的混合模式。此外，缺氧-TME分類器可以明顯區(qū)分HBV-HCC患者的總生存期（圖4B）。圖4C顯示，缺氧-TME分類器可以預測1、2、3和5年的總生存期，AUCs范圍為0.68至0.73。通過與目前的臨床分期系統(tǒng)在總生存率的時間依賴性ROC下的比較，缺氧-TME分類器顯示出比BCLC分期分類更高的功效，與TNM分期系統(tǒng)的性能相似（圖4D）。值得注意的是，缺氧-TME分類器允許對早期HCC階段（TNM I-II）和晚期HCC階段（TNM III-IV）的患者進行進一步細分。缺氧低/TME高晚期 HCC 亞組患者的生存率與 缺氧高/TME低 晚期亞組患者的生存率有顯著差異，但與 缺氧高/TME低早期 HCC 亞組患者的生存率相似（圖4E）。因此，缺氧-TME分類器與TNM分類相結(jié)合，似乎比單獨的TNM分類器提供更準確的預測價值。

圖4???缺氧-TME分類器與其他HCC相關(guān)分子特征之間的聯(lián)系

05? 缺氧-TME亞組中腫瘤的差異

? ? ? ? 作者從幾個方面進一步研究了不同亞組之間的免疫應答相關(guān)基因：主要組織相容性復合體（MHC）、抑制性免疫標志物、激活性免疫標志物、抗炎標志物、pH調(diào)節(jié)標志物等幾個方面（圖5）。與中間混合亞組和缺氧高TME低亞組相比，缺氧高TME高亞組的所有MHC、大部分抑制性免疫標志物（TIM-1除外）和所有激活性免疫標志物的表達量普遍較高。此外，缺氧低-TME高亞組顯示TGFB1（抗炎基因）的表達低于其他兩個亞組。而缺氧高TME低亞組被觀察到有明顯較高的CA9表達，該基因負責pH調(diào)節(jié)。關(guān)于免疫相關(guān)基因的更詳細的結(jié)果也在熱圖中描述（圖S10）。

圖5????基于缺氧-TME分類器的三個亞組的免疫相關(guān)標志物的比較

圖S10????不同缺氧-TME亞組下腫瘤中免疫相關(guān)基因的比較

06 - 缺氧-TME亞組患者腫瘤體細胞突變的差異模式

????????接下來，作者研究了不同缺氧-TME亞組的腫瘤體細胞改變。確定了TCGA-LIHC隊列中前20個變異突變（圖6A）。與缺氧低/TME高亞組相比，有12個突變在缺氧水平高/TME低亞組中顯示出更高水平。特別是TP53突變在缺氧高/TME低亞組中明顯較高。同樣，在低氧/TME高亞組中TP53的平均表達量較低，沒有TP53突變的患者生存率提高，這與以前的研究一致（圖6C,D）。值得注意的是，在TP53突變患者的亞組中，缺氧-TME分類器可以識別預后更好的患者（圖6E）。此外，由于腫瘤突變負荷是一種新興的免疫治療敏感性測量方法，我們還計算了每種腫瘤的TMB評分。缺氧TME亞組間未發(fā)現(xiàn)顯著差異（圖6B）。這些結(jié)果可能表明，缺氧-TME分類器在區(qū)分患者方面比TMB評分更敏感，并且可以更精細地識別P53突變患者更好的預后。

圖6????腫瘤體細胞突變與缺氧-TME分類器之間的關(guān)系

07 - 基于缺氧-TME分類器對治療反應的預測

????????接下來作者測試了缺氧-TME分類器是否可以用來預測接受治療的患者的臨床反應。在索拉非尼和MAGE-A3免疫療法之前，分別收集了腫瘤樣本的測序數(shù)據(jù)。然后評估了缺氧-TME分類器在接受多酪氨酸激酶抑制劑（mTKI）索拉非尼治療的患者中治療反應的預測能力，索拉非尼表現(xiàn)出抗增殖和抗血管生成的活性。拉非尼應答組的患者缺氧評分顯著降低，TME評分較高（圖7A，B）。與缺氧高/TME低患者相比，缺氧低/TME高患者的索拉非尼應答者比例要高得多（59.3%），而混合組和缺氧高/TME低亞組的索拉非尼應答者分別只有13.6%和11.1%（圖 7C）。同樣，對MAGE-A3免疫療法有反應的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者在統(tǒng)計學上分別顯示出較低的缺氧評分和較高的TME評分（圖7D,E）。在缺氧低/TME高亞組中，有治療反應的患者比例最高，而缺氧高/TME低亞組只有14.29%。此外，Proteomap被用來直觀地展示缺氧-TME分類器預測接受MAGE-A3免疫療法的患者的治療反應的潛在機制。有趣的是，Proteomap在缺氧低/TME高和MAGE-A3反應者中的模式相當相似。此外，還觀察到缺氧高/TME低亞組與MAGE-A3無應答者之間的高度相似性（圖7G，H）。綜上所述，這些結(jié)果可能表明，治療前的缺氧TME特征可以描述腫瘤免疫微環(huán)境，從而有利于預測患者的治療反應。

圖7????基于缺氧-TME分類器的治療反應預測

四、結(jié)論

????????本文基于對HBV相關(guān)肝癌中TME細胞狀態(tài)和缺氧相關(guān)基因的綜合分析，開發(fā)了缺氧-TME分類器。分類器的預后預測在各種HCC隊列中得到證實。最佳預后和治療反應與低缺氧/高TME評分有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了基于缺氧和TME細胞特征評估腫瘤特異性生物學的重要性，為HCC的預后和治療評估提供了新的機會。