Schimleck LR, Kube PD, Raymond CA (2004) Genetic improvement of kraft pulp yield in Eucalyptus nitens using cellulose content determined by near infrared spectroscopy. Can J For Res 34:2363–2370. doi: 10.1139/x04-119

摘要

在世界許多涼爽溫帶地區，桉樹（Eucalyptus nitens (Deane & Maiden) Maiden (shining gum)）廣泛種植用于生產紙漿。提高紙漿產量可提高種植園利潤，但傳統評估耗時費力。纖維素含量與紙漿產量密切相關，已被用作林木育種方案的替代指標。然而，纖維素含量的直接測量仍然依賴于濕化學，限制了可處理的樣品數量以及在樹種育種計劃中獲得的后續增益。間接方法如近紅外（NIR）光譜可以實現分析的樣品數的大量增加。在本研究中，比較了使用使用濕化學測定的纖維素含量和通過基于不同取樣強度的NIR校準進行預測的纖維素含量所獲得的增益。基于NIR預測的纖維素含量的遺傳增益高，使用直接測量纖維素可以獲得很大比例的增益【這句什么意思？】。校準是穩健的，通常可以在各個站點之間可靠地使用。 NIR預測的纖維素是高度遺傳的，其遺傳性與纖維素的直接測量相當或優于纖維素。

介紹

在東南澳大利亞州，智利，南非和新西蘭的涼爽溫帶地區，生長了桉樹（Deane＆Maiden）用于紙漿生產（Dean等，1990）。提高從該物種獲得的紙漿的產量是增加種植園利潤率的重要組成部分（Dean等人，1990; Borralho等人，1993; Greaves等人1997）。使用傳統方法的評估需要將樹木切碎，然后在高溫和高壓下在堿性溶液中煮熟以溶解木質素，使纖維素和半纖維素完整（Smook 1982）。這種方法是有限的，因為它是破壞性的（樣本樹需要砍伐），耗時且昂貴（Downes等人1997; Raymond和Schimleck 2002）。育種計劃評估技術的一個重要要求是它們是非破壞性的，能夠快速篩選大量樣品。因此，這些傳統的紙漿產量評估方法不太適合育種計劃。
纖維素含量已被用于樹種育種計劃中。幾項研究表明，它與牛皮紙漿產量密切相關（Dillner等，1970; duPlooy 1980; Wallis et al。，1996a，1996b; Kube and Raymond 2002）比其他方法便宜，并允許更多的樣品（Wallis et al。，1996b; Kube et al。2001; Kube and Raymond，2002）。然而，直接測量纖維素含量的局限性在于它依賴于濕化學，這需要專門的實驗室和熟練的實驗室工作人員。因此，可以處理的樣本數量受到這些實際限制，這又限制了在樹種育種計劃中可以獲得的收益。
幾項研究表明，近紅外（NIR）光譜法可用于預測纖維素含量（Wright等，1990; Garbutt等1992; Clarke and Wessels 1995; Schimleck等，1997; Raymond和Schimleck，2002）和NIR可以大大增加加工樣品的數量（Raymond和Schimleck，2002）。木材的近紅外光譜帶由木材組分中的化學鍵的振動產生，如纖維素和木質素。因此，樂隊的變化反映了木材化學的變化。發生在NIR區域（700?500nm）的光譜由在中紅外（2500?0000nm）觀察到的O璈，N璈和C璈官能團的基本伸縮振動的泛音和組合帶組成， （Barton 1989; Osborne等人，1993）。 NIR分析依賴于創建將大量樣品的近紅外光譜與其已知纖維素含量相關聯的校準。然后校準基于其NIR光譜來預測其他樣品的纖維素含量。雖然近紅外光譜可用于測試大量的纖維素含量的樣品，但估計的誤差可能會比使用濕化學物質時的誤差更大。考慮到這一點，重要的是確定更多樣品的相對益處與較低的精度。
這項研究的目的是評估NIR作為衡量木材纖維素含量在E. nitens樹育種計劃中的工具。它建立在以前對E. nitens中纖維素含量和紙漿產量之間的關系的研究（Kube和Raymond 2002）以及在E. nitens中的纖維素含量的遺傳變異（Kube等人，2001）。在本研究中，使用不同的采樣強度和使用從不同位點采樣的樹開發和比較校準模型。然后，我們估計并比較了這些校準模型中每個纖維素含量的遺傳增益與使用濕法化學方法測量的纖維素含量可獲得的收益。

材料和方法

樣品來源使用的遺傳材料是開花授粉后代

來自維多利亞州中部高原的Toorongo高原的40個本地森林家庭。 1984年在澳大利亞塔斯馬尼亞州北部的三個地點（撥號范圍，氣量范圍和卡莫納）建立了后代試驗。現場詳細情況見表1.試驗設計是一個隨機完整的塊，每個站點16個重復，單個樹地塊間隔3米3米。通過在0.9米的高度采取12毫米樹皮到樹皮核心，在13歲時采集木材樣本。在這個高度上的木材采樣已被證明是全樹纖維素含量和全樹紙漿產量的可靠預測指標（Kube和Raymond，2002）。測定重復樣本約25％的樣品作為對準確性的一般檢查。纖維素測定的標準誤差約為0.3。發現測定是高度可重復的，并且在方差組分的分析中，重復測定效應小（總變異的4％）并且不顯著。從每個家庭隨機抽取約5棵樹。使用盤式粉碎機將木芯還原成小碎片，然后在裝有1mm篩的Wiley磨機中研磨。關于這項研究的更多細節在Kube et al。 （2001）和Kube和Raymond（2002）。
纖維素含量的測定粗纖維素含量（克纖維素？烘干
木材））用Wallis等人的方法測量（1997年）。將非纖維素化合物通過在二水合二甲醚和鹽酸中在90℃的水浴中在搖床上消化1小時而溶解。通過過濾收集殘余物，洗滌，干燥并稱重，以確定粗纖維素的質量。
近紅外光譜將木粉放置在大型NIRSystems樣品中
杯（NR-7070）。在NIRSystems Inc. 5000型掃描分光光度計中，在保持在紡絲樣品架中的樣品的漫反射模式下測量NIR光譜。在1100?500nm的波長范圍內以2nm的間隔收集光譜。儀器參考是陶瓷標準。每個樣本累積了五十次掃描，結果平均。在獲得光譜后，將樣品杯倒空，重新包裝，得到一個重復的光譜。

表2.每個校準組的纖維素含量（克纖維素？克烘干木材）的統計總結？

使用儀器的NSAS？軟件（NIRSystems，Inc. 1990）將重復光譜平均并轉換為二階導數。使用10nm的段寬度和20nm的間隙寬度進行轉化。
纖維素校準從每個位點選擇樣品進行校準開發。在樣品選擇過程中，不使用與纖維素含量相關的信息（由濕化學測定）。兩種方法用于選擇樣品。第一種方法涉及使用現有的北塔斯馬尼亞牛皮紙漿產量校準來預測所有樣品的牛皮紙漿產量。鑒于牛皮紙漿產量和纖維素之間的關系已知很強（Dillner等人，1970; duPlooy 1980; Wallis等人1996a，1996b; Kube和Raymond 2002），假設預測的牛皮紙漿產量的變化將代表纖維素含量的范圍。
根據其預測產量對樣品進行分選，從每個位點選擇20,40和60個樣品，以涵蓋預測的牛皮紙漿產量的范圍。每個樣本被獨立地選擇，其中包括在每個校準集中的極值。極值被包括在校準組中。 WinISI II軟件也用于選擇樣品進行校準（Infrasoft International 2000）。該軟件使用一個鄰域概念來識別光譜獨特的校準樣本。鄰域被定義為樣本附近的空間。為了校準目的，每個鄰域只需要一個樣本（即，不需要鄰域內的其他樣本）。樣本與其鄰居之間的距離被稱為鄰域H.為了選擇用于校準的樣本，識別具有最多鄰居的樣本。當其鄰居（基于預定的H值）被消除時，樣本被保留。然后識別具有最多鄰居的下一個樣本，并且該樣本被保留，并且其鄰居被消除。該過程一直持續到所有樣品都被保留或消除（Infrasoft International 2000）。最初使用0.6的鄰域H來選擇校準樣品，但是選擇來自每組的大多數樣品進行校準。當鄰域H增加到1.2時，確定了與基于預測的牛皮紙漿產量所選擇的尺寸相似的樣品組。三十七個樣本被選為Dial，59個為Gog，45個為Kamona。表2總結了每個站點的校準集。
所有校準都是使用NSAS軟件（版本3.52）和二階導數譜創建的。部分最小二乘法（PLS）回歸用于具有四個交叉驗證段和最多10個因子的校準。 NSAS軟件通過確定每個因子的交叉驗證的均方誤差（MSECV）與最小MSECV的比值，推薦用于每個校準的最終數量的因素。當比率首先降到1.25以下時，那就是推薦因素的數量（NIRSystems 1990）。

校準統計在本研究中，校準適合度的測量
數據是標準誤差（SEC）（Miller 1989; Workman 1992），由此給出
NC
（y $ i - yi）2
[1] SEC = i = 1（NC≤k≤1）

其中y i - yi）2
[2] SEP = i = 1（NP≥1）

其中NP是預測集中的樣本數。測定系數（R2）也用于評估校準性能和校準性能
用于預測目的。

估計遺傳增益估計遺傳力及其標準誤差

濕化學纖維素含量和NIR預測纖維素含量

其中h2是狹義的遺傳; 2f，2f.s和2e分別是家庭，家庭的方差分量
按站點和錯誤; r是關系系數。
所使用的系數為0.4，假設自給率約為30％（Griffin和Cotterill 1988）。
表3.每個部位的纖維素校準總結。

通過擬合以下模型計算方差分量
[4] Y =？+ SITE + REP + FAM + FAM.SITE +
其中Y是每個性狀的數據向量; ？是每個性狀的平均值？站點是作為固定因素的網站效應; REP是作為固定因素擬合的場內復制效應; FAM是作為隨機因素擬合的家庭效應; FAM.SITE是以隨機因素擬合的逐站互動效應;并且是殘差的向量。數據分析使用ASREML進行（Gilmour等，1999）。
通過計算個體樹繁殖價值，選擇前5％的樹木，然后確定所選群體的平均值來估計遺傳增益。通過擬合以下模型估算個體樹種繁殖值：
[5] Y =？+ SITE + REP + TREE + FAM.SITE +
其中Y，？ SITE，REP，FAM.SITE，如前所述，TREE是個體樹繁殖值（加性遺傳效應）。假定相關系數為0.4，則計算添加劑遺傳效應。用ASREML計算這些育種值。
對五個變量中的每一個分別計算育種值：濕化學纖維素含量;基于每個位點20,40和60個校準樣品的NIR預測的纖維素;和基于使用WinISI軟件選擇的校準樣本的NIR預測。對于每個這些變量，測試了四個選擇場景。首先，所有NIR預測均基于本地站點校準模型。第二，第三和第四種情況測試了三種不同的現場校準模型（即Dial，Gog和Kamona校準模型）。當使用場外校準模型時，我們限制了數據集以排除本地站點數據。例如，當使用撥號校準模型時，我們排除了撥號數據，僅包括來自Gog和Kamona的數據。
對于每個變量和每個選擇情景，選擇了最優育種（最高育種值）樹。這是分開進行的，用于正面選擇（選擇后代）和向后選擇（從父母中選擇）。

對于前瞻性選擇，選擇前30棵樹，代表人口的前5％。對于倒退選擇，選出前六名父母，或父母的前15％。通過平均所選群體的育種值計算遺傳增益，并且相對于通過使用濕化學纖維素測定評估和選擇所有樹可以獲得的增益來表示。

結果與討論

每個部位的纖維素校準為每個部位獲得纖維素校準，然后
用于預測現場所有樣品的纖維素含量。表3提供了每個校準的總結統計。
撥號校準強，特別是20樣本校準（R2 = 0.92）。強R2和低SEC可能是基于其他撥號校準所得結果的樣品選擇的假象。 40和60s樣本校準具有相似的統計，并且當用于預測所有Dial樣品的纖維素含量時，兩者都表現良好。相比之下，20樣品校準表現不佳。基于WinISI選擇的樣本的撥號校準具有很強的校準統計（圖1a），并且在應用于所有撥號樣本時表現良好（圖1b）。
所有Gog校準都推薦兩個因素，R2為0.61?0.77。 20樣本校準盡管有很強的統計，但在用于預測所有Gog樣品的纖維素含量時表現不佳。最佳預測結果由40個樣品校準和WinISI選擇的樣品校準提供。這些校準的R2和SEP差于Dial。
Kamona校準一致地提供了三個站點的最強校準統計。校準R2的范圍為0.91至0.99，海上測量范圍為0.27至0.46。校準也提供了纖維素含量的最佳預測。通過WinISI選擇的樣本校準（圖2a和b）給出最強的R2（0.87），可以獲得每次校準的類似預測統計量。使用20樣品Kamona校準預測的纖維素含量的R2和SEP與使用較大樣品組獲得的校準獲得的相似，這與使用Dial和Gog校準不同。
結果表明，20個樣本不足以充分描述大約180個樣本集合中存在的變異。基于40個樣本的校準就足夠了。結果還表明，基于預測的牛皮紙漿產量或WinISI的樣品選擇提供了選擇校準樣品的有用方法。
一個地點（Gog）的校準明顯比其他兩個地點（Dial和Kamona）的校準差。對此沒有明顯的解釋。纖維素數據的分析（參見Kube等人2001）并沒有表明在Gog中濕化學纖維素含量估計不好，也沒有出現任何大的基因型環境相互作用（這將表明不同的遺傳反應在不同的網站）或任何理由懷疑Gog校準模型中使用的任何數據。

圖1.使用WinISI（a）校準和（b）預測選擇的樣品獲得的撥號校準結果。使用37個樣品開發校準，并在168個樣品上進行測試。實驗纖維素由濕化學測定;通過近紅外光譜測定NIR纖維素。 SEC，校準的標準誤差; SEP;標準預測誤差。

圖2.使用WinISI選擇的樣品獲得的Kamona校準結果，（a）校準和（b）預測。使用45個樣品開發校準，并在188個樣品上進行測試。實驗纖維素由濕化學測定;通過近紅外光譜測定NIR纖維素。 SEC，校準的標準誤差; SEP;標準預測誤差。

有趣的是，Gog的木材性質與其他兩個位置的木材性質有所不同，其中基本密度和纖維素含量都明顯更高（Kube等人，2001）。

遺傳增益使用濕度估計纖維素含量的遺傳力

化學數據和NIR預測的纖維素含量的遺傳率如表4所示。隨著校準模型的采樣強度的增加，NIR遺傳力增加。錯誤差異很小

每個校準模型之間的差異（平均值為0.87），遺傳變化是加性遺傳變異估計值增加的結果。這表明基于更多樣本的校準模型能夠更好地區分遺傳變異。
NIR可以提供纖維素含量的潛在遺傳增益的很大比例（表5），因此似乎是選擇改良基因型的可靠方法。在每棵樹上采用濕化學方法選擇纖維素含量時，我們發現預測的變化范圍為41.5％?43.0％（偏離1.5個百分點）。使用時可以實現大約90％的增益

表4.使用不同的近紅外（NIR）校準方法的纖維素含量（％）方差分量和遺傳力（？標準誤差）。

表5.使用正向選擇策略，使用不同的近紅外（NIR）校準方法獲得纖維素含量（％）。

注：收益表示為通過評估每棵樹所獲得的收益的一個比例
對于使用濕化學方法的纖維素含量。 a WinISI使用的樣本數量在Dial為37，Gog為59，在Kamona為45。

表6.使用反向選擇策略，使用不同的NIR校準方法獲得纖維素含量（％）。

注：收益表示為通過評估每棵樹所獲得的收益的一個比例
對于使用濕化學方法的纖維素含量。 a WinISI使用的樣本數量在Dial為37，Gog為59，在Kamona為45。

NIR預測的纖維素。使用最好的近紅外校準，預測變化范圍為41.5％至42.8％（轉變1.3個百分點）。
隨著校準模型的采樣強度的增加，遺傳增益增加（表5）。使用本地現場校準模型，最小密集采樣方法通過使用濕化學評估所有樣品得到73％的增益。這個模型是從約10％的樹木（每個站點20個）構建的。隨著每個站點的樣本數量的增加，收益穩步上升，大約90％的潛在收益可以實現。使用WinISI軟件根據光譜特征選擇樣本增加了收益，并依賴于較少的樣本來構建校準模型（該方法平均每個站點抽取47棵樹）。
當使用場外校準模型時，NIR也能夠提供良好的遺傳學效益（表5）。在本研究中測試了三個非現場校準模型。其中兩個，收益通常低于使用當地現場模式時的收益，其中約10％的潛在收益被丟失。然而，對于第三（Kamona）來說，收益相似或略高。這個數據表明，為了樹木繁殖的目的，可以構建一個在一定范圍的站點上應用的通用校準模型。
表5中的結果是基于正向選擇的育種策略的收益。正向選擇策略是從被測實際的樹木中選出新的育種或部署種群。然而，大多數先進的樹種育種策略都使用向前和向后的選擇。反向選擇策略是將來自已知父母的后代的信息相結合以選擇最佳父母。反向選擇策略更可靠，因為許多樣本用于測試每個父母。然而，正向選擇策略可以為精英父母的后代提供新的改進選擇。
表6顯示了基于反向選擇的育種策略的NIR的收益。在反向選擇策略下，NIR纖維素可以提供與纖維素直接測量相同的收益。使用WinISI構建的模型是最好的，但基于至少40個樣本的任何模型提供了超過90％的收益。當使用WinISI選擇的樣品時，所有非現場模型都能夠提供100％的收益。該數據表明，對于反向選擇，NIR是選擇纖維素含量的非常強大的方法，任何型號都可以自信地使用。
校準樣品的選擇本研究的一個重要方面是選擇樣品進行校準。使用兩種方法，并且兩者都不需要任何纖維素含量的任何先驗知識。
第一種方法涉及預測來自每個位點的所有樣品的牛皮紙漿產量，然后選擇用于纖維素校準的代表性樣品（每個位點20,40和60個樣品）。該方法依賴于具有現有的NIR牛皮紙漿產量校準和纖維素含量與硫酸鹽紙漿產量之間的強關系，這可以基于廣泛用于紙漿生產的不同桉樹種的幾項研究的結果來確定（Dillner等人，1970 ; duPlooy 1980; Wallis等人1996a，1996b; Kube和Raymond 2002）。基于這種選擇方法的纖維素校準是成功的，因為使用NIR預測的纖維素含量獲得的遺傳增益是最大可能增益的很大比例。
第二種方法涉及使用鄰域概念來識別用于校準的光譜唯一樣本，因此不需要現有的校準。使用其NIR光譜選擇的樣品獲得的結果表明，該方法可以成功地用于鑒定校準樣品。使用這種方法的遺傳利益（最大可能增益的90％）超過了根據其預測的牛皮紙漿產量選擇的樣品獲得的增益，遺傳力估計也更強。將附加樣品添加到纖維素校準物中的遺傳增益的改善可能部分地是在預測組中包括更多校準集樣品的結果。用于相應校準的樣品被包括在每個預測組中。通常在NIR研究中，校準樣本不包括在預測組中，但是在本研究中進行了這一操作，以確保將所有校準應用于相同大小和組成的測試組。

結論

NIR預測的纖維素含量似乎是樹種育種的理想工具。它與牛皮紙漿產量密切相關，這在許多育種計劃中具有很高的經濟重要性。該研究發現纖維素含量的強校準，其他研究已經顯示纖維素含量和牛皮紙漿產量之間的強關系，使用直接測量纖維素和NIR預測的纖維素。
NIR預測的纖維素也處于強烈的遺傳控制之下，其遺傳性與纖維素的直接測量相當或優于纖維素。基于NIR預測的纖維素含量的遺傳增益很高，并且通過良好選擇的校準，可以使用NIR預測獲得使用直接測量纖維素可獲得的大部分增益。
校準模型也顯得非常強大，并且通過精心挑選的校準，模型可以跨站點可靠地使用。每個站點建立了40個或更多樣本的良好模型。使用WinISI II軟件選擇樣品增加了收益，并依靠較少的樣品來建立校準。