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摘要
質譜流式組織成像（Imaging mass cytometry, IMC）能夠對細胞類型和狀態進行高維單細胞分析。在大規模細胞術中，稀土金屬被用作抗體的報告者。使用質譜細胞儀分析金屬豐度可以測定單個細胞中的標志物表達。質譜細胞術以前只應用于細胞懸浮液。為了獲得空間信息，作者將免疫組化和免疫細胞化學方法與高分辨率激光消融耦合到CyTOF質譜。這種方法能夠以亞細胞分辨率同時成像32種蛋白質和蛋白質修飾;隨著其他同位素的可用性，將有可能測量100多種標記物。作者將成像質量細胞術應用于人類乳腺癌樣本，從而可以描繪細胞亞群和細胞間相互作用，并突出腫瘤的異質性。質譜細胞計數成像是對現有成像方法的補充。它將使組織異質性和功能的基礎研究成為可能，并支持醫學向個體化分子靶向診斷和治療的過渡。
成像質譜細胞儀
作者在這里介紹一種成像技術，該技術擴展了基于CyTOF的質譜細胞術的多重分析功能，以進行空間分辨測量。他們開發了一個工作流程（圖1），將質譜細胞術、ICC和IHC分析與高分辨率激光消融系統相結合，以便在1μm的細胞分辨率下分析貼壁細胞和組織切片。在第一步中，使用常規ICC和IHC方案（制備細胞樣品或組織切片以進行抗體標記。選擇抗體來靶向與乳腺癌相關的蛋白質和蛋白質修飾。在染色之前，抗體被標記有一種獨特的稀土金屬同位素，其原子質量是確定的。目前，有32種稀土金屬同位素可以作為報告者。空氣干燥后，將樣品放置在最近開發的激光消融室中，以最大限度地減少氣溶膠擴散，以進行高分辨率，高通量和高靈敏度的分析。然后將組織逐點逐行激光刻蝕，然后通過混合的氬氣和氦氣流將刻蝕材料輸送到CyTOF質量細胞儀。
根據本研究中提供的數據集確定，假設泊松統計，在20 Hz下單個激光射出的信號是完全分離的（圖2），檢測限約為6個離子計數（對應于～500個分子）。經過數據預處理后，使用每個激光拍攝的坐標繪制32個瞬態單同位素信號，并通過疊加所有分析的測量通道生成樣品的高維圖像。接下來，使用分水嶺算法對單細胞特征進行計算分割，并提取單細胞標志物表達數據。這些單細胞數據用于所有下游數據分析，并研究來自20名乳腺癌患者的21個腫瘤和正常樣本中的細胞亞群。
方法的有效性
為了評估IMC對IHC的有效性，作者首先使用FFPE乳腺癌樣品進行實驗，以確?？贵w的金屬標記不會干擾其靶標特異性。使用IFM分析比較了來自相同類型腫瘤的210號和37號組織的連續切片在未標記和金屬標記抗體的狀態（圖2a、圖supp 2）?？梢杂^察到金屬標記后，抗體特異性沒有明顯變化。定量分析表明，未標記抗體和金屬標記抗體之間每個標記物的平均單細胞熒光強度的差異雖然顯著，但很?。篽istone H3為-7%（H3;P < 4.7 × 10?10），epidermal growth factor receptor 2 為27%（HER2;P < 1.0 × 10?12），cytokeratin 8/18為27%（P <3.7×10?3）， E-cadherin 為7% （P < 2.5 × 10?11）， ?2% 為 vimentin （P < 4.2 × 10?2），cytokeratin 7為22%（P <5.8×10?36) (supp 3）。這些差異完全在實驗過程中以及相似但不相同的連續組織切片中觀察到的可變性范圍內。單細胞標記物熒光強度分布的一致性進一步證實了未標記抗體和金屬標記抗體之間的相似性（圖supp 3）。
然后，作者研究了由IMC生成的圖像是否再現了染色模式和由IFM標記的細胞百分比。發現在一系列組織切片上，IFM和IMC中表達分析標記物的腫瘤細胞百分比相似(圖3b): H3分別為100%和100%;HER2為75%和79%;cytokeratin 8/18分別為63%和66%(圖6)。
作者還評估了單重IHC，雙重IFM和32位IMC分析是否產生一致的結果。質譜流式組織成像在使用相同的抗體（CK 8/18和H3）或使用不同的抗體克隆針對同一腔內 luminal HER2+型腫瘤（編號210）中的相同靶標（HER2和PR）進行實驗時，染色模式與單級IHC相似。對于IHC和質譜流式組織成像，>90%的上皮細胞表達這些標記物（圖supp 6）。此外，32-plex cyTOF與雙重IFM分析中的細胞空間分布和腫瘤細胞的百分比也顯示出相似性(圖2b和圖supp 4)?？傊?，這些結果表明多路復用并沒有導致抗體行為的顯著變化。
最后，作者還確定IMC是否可用于評估ICC方案中的貼壁細胞系。
這些結果表明，質譜流式組織成像能夠以亞細胞分辨率同時進行高度多路復用的組織和貼壁細胞的成像。未標記抗體和金屬標記抗體之間的特異性和性能沒有明顯變化，單重IHC，雙重IFM和IMC的多重分析中使用的抗體之間也沒有明顯的變化。
乳腺癌腫瘤異質性分析
在乳腺癌中，根據雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人類表皮生長因子受體（HER2）的表達可將乳腺癌區分成為4類：HR+ HER2-，HR+ HER2+，HER2+，TNBC。作者使用IMC技術來描述細胞亞群表型，以及探索亞型內、亞型間的異質性。在組織微陣列（TMA）上分析了21個FFPE樣本，之前病理學家將其分為主要乳腺癌亞型或正常。并使用spanning-tree progression analysis of density-normalized events (SPADE) 分析確定了細胞亞群和細胞轉變（圖5a）。
結束語（自己寫的）
近年來，單細胞分析成為了一大熱門，從單細胞轉錄組到單細胞蛋白，再到單細胞代謝。多組學單細胞已經成為趨勢。隨著時間的推移，科研工作者會向著空間單細胞組學去努力，從2維到3維。目前，市面常見的空間轉錄組還沒到達單細胞水平，單細胞蛋白的可檢測指標相較于轉錄組來說信息還是很少，空間代謝也在萌芽中。但在科研工作者的努力下，未來必然會被突破。
[參考文獻]
Giesen C, Wang H A O, Schapiro D, et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry[J]. Nature methods, 2014, 11(4): 417-422.
