上個月online的一篇nature。在這篇文章中，作者對來自11個DCM患者心臟、15個HCM患者心臟和16個non-failing hearts的左心室樣品進行了單核細胞測序。DCM和HCM的心臟轉錄圖譜在組織和細胞水平具有廣泛的重合。
DCM和HCM的各種圖譜類單細胞文章其實都出了一些了，之前也寫過一些：
單細胞核測序揭示擴心病兒童細胞特征調節的新機制
單細胞核測序和空間轉錄組解析肥厚性心肌病的心臟病理性重構的譜系特異性調節改變
單細胞轉錄組解析肥厚性心肌病發病機制
這一篇依然可以發nature，說明它肯定有非常值得學習的地方。
1. Expression profiles of cardiomyopathies
作者對11個DCM患者心臟、15個HCM患者心臟和16個non-failing hearts的左心室樣品進行了單核細胞測序。DCM患者的LVEF都<20%，HCM患者中，7個LVEF<50% (HFrEF)，8個LVEF>=50% (HFpEF)。
Fig 1A, B：質控后得到592,689個細胞核，根據轉錄相似性聚為了21個群。B圖相似性聚類樹的算法可以參考不同單細胞群之間的相關性分析。
得到的細胞類型還挺全的，正常心臟里的細胞類型參考：人類心臟單細胞圖譜和單細胞測序揭示小鼠心臟非心肌細胞之間的異質性和互作。
Fig 1C：不同樣品的細胞比例，可以看到樣本間的異質性還是比較大的。整體上細胞豐度依次是心肌細胞，成纖維細胞，內皮細胞，壁細胞，巨噬細胞和淋巴細胞。和NF相比，DCM和HCM心臟出現了明顯的心肌細胞比例下降以及血管平滑肌和活化成纖維細胞比例的增加。此外，和NF相比，DCM心臟出現了明顯的成纖維、淋巴和巨噬細胞的增加，HCM則出現了淋巴管內皮細胞的增加。
Fig 1D：這個圖是一個pseudo-bulk sequencing的PCA分析，可以看到PC1把NF和DCM, HCM區分開了，PC2把性別區分開了。DCM和HCM則不能很好的區分開。（參考：轉錄組表達矩陣為什么需要主成分分析以及怎么做）
這個比例變化的比較是用scCODA做的
隨后作者比較了一下NF和心肌病的轉錄差異
Fig 2A：作者比較了 DCM vs NF, HCM vs NF, DCM vs HCM的總的差異基因。從bulk水平來看，DCM vs HCM的差異基因顯著少于DCM vs NF和HCM vs NF，與前面1D的pca結果相一致。
Fig 2B： DCM vs NF, HCM vs NF, DCM vs HCM的bulk的差異基因和各細胞類型的差異基因。可以看到成纖維的差異基因是最多的。DCM和HCM在各個細胞類型中的差異基因也比較少，在新肌里面稍微多那么一點點。提示心肌病也能存在著類似的轉錄模式，這也和前面基于蛋白組學的研究相一致1。
這里的差異基因計算都是用的
false discovery rate (FDR) < 0.01
FDR其實就是矯正后的p值
為了進一步探究心肌病患者的轉錄差異，作者比較了HFrEF和HFpEF的HCM樣品。在FDR<0.01的標準下，所有的細胞群都沒有鑒定出差異基因。
Fig 2C： 隨后作者探索性的探究了在心肌中存在差異表達的基因中具有性別差異的基因。鑒定出了包括THRB在內的5個基因 (FDR < 0.10)在心肌細胞狀態和患者性別不同的情況下存在表達差異。提示一小部分基因可能在不同性別心肌病患者中存在功能差異（？？？前面算差異基因還是用的FDR < 0.01，到這里就變成0.1了？p.adj都放寬到0.1了，還只有五個差異基因，這個圖也值得放在主圖嗎？前面算HFrEF和HFpEF的HCM樣品的差異基因怎么不把FDR卡到0.1呢？）
Fig 2D： 基于DCM和HCM跟NF相比 各細胞類型的差異基因，作者做了通路富集分析（畫法參考一張圖展示多組富集分析結果）。整體上看， DCM vs NF和HCM vs NF的差異基因富集到的通路在各細胞類型中都比較相似。此外，心肌細胞不管是上調還是下調的pathway，p值都不是那么顯著，NES也比較接近于0，也就是說上調下調的變化比較輕微。相反，成纖維的多條通路出現了顯著變化，包括補體系統、中性粒細胞脫顆粒、維生素和輔因子代謝、鉀離子通道和神經系統等。相似的，巨噬細胞出現了多條通路的顯著下調，包括中性粒細胞脫顆粒、第二信使分子的產生和CD28家族共刺激分子的生成等。
為了探究DCM和HCM的轉錄差異是否是由基因背景導致的，作者對42例患者樣品中的40例進行了全外顯子測序，以期在已知的心肌病基因中鑒定loss-of-function (LOF)變異。（看起來像是文章修回的時候補的數據）
Extended Data Fig. 6a： 和預期一致，作者在DCM中觀測到了TTNLOF carriers (4 out of 10 patients)，HCM中的MYBPC3LOF carriers (3 out of 15 patients)和MYH7 pathogenic variant carriers (5 out of 15 patients)。
Extended Data Fig. 6b-d：然而carriers和non-carriers之間沒有明顯的轉錄差異。
2. Changes in cell subpopulations
隨后作者對豐度比較高的幾個細胞群進行了二次聚類。和NF相比，作者在HCM或DCM的成纖維，巨噬，內皮，VSMC和淋巴細胞中都發現了至少1個亞群的顯著比例變化。
比如內皮亞群EC-TMEM163在HCM和DCM中都出現了上升。這個細胞群高表達促血管生成的基因比如KIT, NRP2, COL15A1, PCDH17和ITGA6。相似的，淋巴細胞中的LC-LINGO2在HCM和DCM中都出現了比例上升。和其他淋巴細胞相比，這個淋巴細胞群高表達NK細胞marker如KLRF1, GNLY, CD244和PRF1。
在巨噬細胞中，作者鑒定出了4個亞群（Extended Data Fig. 8a-d）。其中Prolif巨噬在HCM和DCM中都出現了比例下降（Extended Data Fig. 8e）。巨噬細胞marker CD163和增殖marker Mki67共染證實了這個現象（Extended Data Fig. 8f）。隨后根據CCR2對細胞進行劃分結果發現Prolif巨噬在基因表達上類似于修復性CCR2-組織原位巨噬細胞（Extended Data Fig. 8g-i）。
g圖和i圖的畫法可以參考：scRNAseq靈活的點圖繪制：FlexDotPlot
3. Activated fibroblasts in DCM and HCM
在前面的Fig 1c和Extended Data Fig. 4作者發現了DCM和HCM患者都出現了明顯的活化成纖維比例的增加。而且這群細胞幾乎只存在于心肌病患者(2,989 DCM, 2,196 HCM and 25 NF nuclei)。
Fig 3a：活化的成纖維細胞主要來自DCM患者P1304和HCM患者P1425。
Fig 3b：這個細胞群高表達已知的活化成纖維細胞基因如 POSTN, NOX4, FAP, COL1A1和COL1A2以及此前沒有報道過的基因如family with sequence similarity 155 member A (FAM155A (又稱NALF1))和teashirt zinc finger homeobox 2 (TSHZ2)。
作者還根據高表達基因對這群細胞做了染色以證實這群細胞的存在，結果放在supplement。
Fig 3c-e：為了探究這群細胞的來源，作者在這群細胞豐度比較高的兩個樣品P1304和P1425中做了成纖維細胞的擬時序分析。（slingshot和scVelo做的），可以看到這群細胞確實是靜息的成纖維分化來的。
Fig 3f：隨后作者使用tradeSeq計算了擬時差異基因，發現一些基因如SLC44A5, COL22A1, POSTN, AEBP1, JAZF1和THBS4延著分化軌跡表達增加。一些基因如NEGR1, PDGFRA, C7, FBLN5和COL4A4則隨著分化軌跡出現表達下降。還有一些基因如KCNMA1, HIP1, PRRX1和PRELP在軌跡的不同的stage顯示出增加的表達。這個轉化是否存在平臺期還需要進一步探究。
AEBP1在宋江平老師和張澤民老師合作的那篇從單細胞水平解析炎癥和纖維化在心衰中的交織作用中也被鑒定為ACTA2+肌成纖維細胞的關鍵心肌纖維化調控分子。但是在這篇文章里，后面做crispr screening提示這個分子沒有很大意義。
4. Validation of activated fibroblasts
為了驗證這群活化成纖維細胞是否廣泛在心肌病患者中存在，作者使用了Myocardial Applied Genomics Network (MAGNet)研究中的DCM, HCM，圍產期心肌病和NF的bulk RNAseq測序數據。作者使用自己的數據中的單細胞的細胞群特異表達基因對bulk RNAseq數據進行了反卷積分析，并估計了每個病人樣本中活化成纖維細胞的比例。
Fig 3g：在同時具有單細胞和bulk RNAseq數據的34個sample中，4例存在活化的成纖維細胞。而在只有bulk RNAseq數據的樣品中，17/155的DCM患者，4/17的HCM患者存在活化的成纖維細胞，NF controls中則都不存在。這些結果進一步證實了活化的成纖維細胞只在心肌病患者中存在。
作者還比較了有和沒有活化成纖維細胞的患者的LVEF值，顯示沒有顯著差異。可能是因為樣本量比較小。
Fig 3h：作者又在另外兩個bulk RNAseq數據集中使用反卷積探究了活化成纖維細胞的存在情況，結論和前面一致。
作者還在患者心臟切片中對這群細胞進行了染色，結果放在supplement。
5. Cardiac fibrosis assay
Fig 4a：最后，作者使用了一個crispr screen去探究TGFβ1刺激下的心臟成纖維細胞向肌成纖維細胞演變的過程。簡單來說，Cas9表達的心臟成纖維細胞被置于384孔板，使用1-4 single guide RNAs (sgRNAs)對前面fig 3f中鑒定出來的27個擬時相關基因分別進行了knock out。(一般針對同一個基因的sgRNA都會設計多個)
這里設計的sgRNA包括：
目標基因的sgRNA（1-4 per gene, n=62）
Non-targeting negative control sgRNA (n=12)
CM-specific negative control gene sgRNA (n=10)
Positive control sgRNA (n=16)
Fig 4b： αSMA是肌成纖維細胞的特征蛋白，也是指征間充質細胞最常用的分子標記之一（Tallquist et al., Nat Rev Cardiol 2017）。和預期的相一致，給予了TGFβ1刺激的心臟成纖維細胞出現了明顯的表型轉變，出現了SMA的表達。（作者把SMA的表達當作成纖維出現了向肌成纖維轉化的特征觀測指標）
ACTA2（actin alpha 2）是一種肌動蛋白，有多個別名，包括α-肌動蛋白、α-肌動蛋白-2、主動脈平滑肌或α平滑肌肌動蛋白 (α-SMA)。Actins是球狀多功能蛋白質的一個家族，形成微絲。ACTA2是6種不同肌動蛋白亞型之一，參與平滑肌的收縮。ACTA2（和所有actins一樣）極其保守，幾乎在所有哺乳動物中都有發現。在人類中，ACTA2由位于10q22-q24的ACTA2基因編碼。該基因突變導致多種血管疾病，如胸主動脈疾病、冠狀動脈疾病、中風、煙霧病和多系統平滑肌功能障礙綜合征。ACTA2（α-SMA）目前被認為是肌成纖維細胞的標志。
Fig 4c：作為陽性對照，作者在心臟成纖維細胞中knock out掉了一些已知的參與TGFβ信號通路的基因，包括ACTA2, TGFBR1, TGFBR2, SMAD2和SMAD3。結果顯示 ACTA2和TGFBR1的所有的 sgRNAs，3個TGFBR2 sgRNAs其中的2個，都出現了明顯的肌成纖維轉化下降。SMAD3 sgRNAs也出現了輕微的肌成纖維轉化下降。作為陰性對照，作者設計了12個non-targeting control (NTC) sgRNAs和10個靶向5個心肌特異性基因的sgRNAs。12個NTC中的9個和除了1個以外所有的心肌特異性sgRNAs都對TGFβ1 刺激下的成纖維向肌成纖維轉化沒有影響。而在作者選的27個擬時相關基因中，軌跡中期成纖維的至少1個基因的一個sgRNA和分化軌跡晚期升高的6個基因的sgRNA顯示出了明顯的肌成纖維生成減少(more than 75%)。
Fig 4d：在前面的7個基因中，PRELP和JAZF1 sgRNA與陽性對照和隱性對照相比出現了明顯的SMA的下降。提示他們可以作為心臟纖維化的治療靶點。
延伸：
肌成纖維細胞是膠原的主要生產者，膠原在正常情況下，負責連接受損組織，成為創傷修復的腳手架。隨著修復的開始，肌成纖維細胞和膠原逐漸減少甚至消失。在纖維化疾病中，肌成纖維細胞會持續生產膠原，有時這一過程能被抗炎癥藥物延緩，但目前治療纖維化的途徑只有器官移植。
為了鑒定肌成纖維細胞的來源，研究人員對小鼠腎纖維化模型進行了研究，他們發現：
? 處于靜息狀態的成纖維細胞，增殖形成了超過半數的肌成纖維細胞。
? 35%的肌成纖維細胞由間充質干細胞生產，這些來自骨髓的間充質干細胞，先移動到受損位點，然后分化成為肌成纖維細胞。
? 另外10%的肌成纖維細胞，是內皮細胞間充質轉換（EndMT）的結果。在這一過程中血管細胞先轉變為間充質細胞，然后再形成肌成纖維細胞。
? 最后5%的肌成纖維細胞，來自于上皮細胞間充質轉換（EMT）。研究還顯示，EMT 和EndMT形成肌成纖維細胞，依賴轉化生長因子TGF-B1。
在心血管領域，周斌老師去年發表的一篇circulation報道了使用
EndoMTracer示蹤肌成纖維細胞，揭示了在早期胚胎心臟發育中內皮細胞向間充質細胞轉變的過程，但成體心臟纖維化中內皮細胞不會發生瞬時EndoMT，也不會形成肌成纖維細胞。而心臟中的成纖維細胞在損傷過程中會被激活，表達間充質基因，并促進損傷區纖維化，提示心臟纖維化的治療靶點應集中在成纖維細胞。
參考文獻：
- Chen, C. Y. et al. Suppression of detyrosinated microtubules improves cardiomyocyte function in human heart failure. Nat. Med. 24, 1225–1233 (2018).
