1. Age-Dependent Changes in Cellular Composition in Pediatric DCM

作者對6例因終末期擴心病進行心臟移植的患兒（0.5, 0.75, 5, 6, 12和13歲）的左室組織進行了單細胞核測序（沒有正常對照哦）。患者信息如下表：

Fig 1A：一共得到18211個細胞核，分為14個cluster。注釋得到6個主要細胞群，包括心肌細胞（3群），成纖維細胞（1群），內(nèi)皮細胞（3群），白細胞（1群），周皮細胞（1群），平滑肌細胞（1群）和炎癥細胞（1群）。
Fig 1B C：特征性marker基因的表達。基本都比較常規(guī)。其中有兩群被注釋為low.Q的細胞（每個核有很高的基因數(shù)，有可能是雙核或多核）還有一群細胞，通過了質(zhì)控但是同時表達FB核EC的基因，就被注釋為EC-FB。還有一群表達神經(jīng)元marker（比如neurexins, NCAM）但是不表達經(jīng)典的浦肯野細胞或其他神經(jīng)細胞特異性基因，因此被注釋為neuronal-like cells。

心肌細胞：TNNT2
內(nèi)皮細胞：CDH5
成纖維細胞：PDGFRA
周皮細胞：PDGFRB
平滑肌細胞：MYH11
免疫細胞：PTPRC (CD45)

Fig 1D：不同病人的細胞umap圖和細胞比例。結(jié)果顯示，患者年齡越大，成纖維比例越高，心肌細胞比例越低。而且隨著年齡增加，白細胞和內(nèi)皮細胞也有增加的趨勢，但是沒有統(tǒng)計學意義。

2. Age-Dependent Regulation of Fibroblasts in Pediatric DCM

前面的結(jié)果提示，隨著DCM患者年齡增加，成纖維細胞逐漸增多。所以作者對這個結(jié)果做了驗證。
Fig 2A：成纖維的markerPDGFRA的免疫熒光染色和前面的結(jié)論一致
Fig 2B C：在更大的DCM隊列 (62個病人) 中使用MRI監(jiān)測了心臟纖維化情況，提示存在年齡依賴的延遲增強。而且這種現(xiàn)象與左室射血分數(shù)不相關(guān)。

Fig 2

為了更近一步探究成纖維細胞的分子特征，作者對所有的成纖維細胞做了擬時續(xù)分析。使用的是monocle2。

Fig 3A：monocle將成纖維細胞分為7個states。
Fig 3B：State1的成纖維主要在<6歲的患者中存在。State6的成纖維主要在12-13歲患者中存在。
Fig 3C：State1和State6的擬時差異基因
Fig 3D：State1和State6的擬時基因的富集結(jié)果。State1主要富集到RNA splicing之類的通路，State6富集到很多膠原形成通路。
Fig 3E：查看了State1和State6的一些纖維形成膠原以及各種其他膠原如糖蛋白，蛋白多糖和金屬蛋白酶的表達，發(fā)現(xiàn)在兩組間存在一定差異。

Fig 3

隨后作者將成纖維細胞按照患者的年齡分為三組 (<1y, 5-6y和12-13y)。

Fig 4A-D：三組的差異基因（這里只放了兩個）。<1y的成纖維高表達EGR1，這個基因可以誘導膠原表達但是也可以誘導心臟成纖維細胞凋亡，同時這組細胞還表達LIF (leukemia inhibitory factor)的受體COL6A6，這個基因可以降低纖維含量和基質(zhì)蛋白酶活性，還有SULF1，可以促進血管內(nèi)皮生長因子的生物活性。12-13y的成纖維細胞高表達的基因包括CYP1B1，這個基因是內(nèi)源性代謝通路的調(diào)節(jié)分子，參與angiotensin II介導的纖維化。一些成纖維細胞活化marker如periostin (POSTN)和fibronectin (FN1)也出現(xiàn)升高。
Fig 4E：免疫熒光驗證COL6A6的蛋白表達，和上面的結(jié)果一致。

因為這些基因表達模式可能潛在的受到基礎心臟疾病及心臟移植的影響，作者比較了未受損的出生后小鼠和成年鼠的成纖維細胞基因表達（用的是已經(jīng)發(fā)表的RNAseq數(shù)據(jù)）

Fig 4F G：RNAseq的一些基因表達變化情況與單細胞的結(jié)果一致（這里如果是沒有變化的才可以說明DCM時間越久/患兒年齡越大，成纖維細胞的促纖維化功能越強吧。這個結(jié)果只能說成纖維細胞的促纖維化功能與年齡有關(guān)，不過這也可以理解，possibly reflecting the need for additional stability or disease- related processes in hearts beyond infancy. ）

Fig 4

小結(jié)：這些數(shù)據(jù)提示心臟成纖維細胞的數(shù)量和轉(zhuǎn)錄模式在兒童和青少年中存在差異。

之前看過一篇nature，做的白癜風的發(fā)病機制，白癜風在人體的分布也是因為身體不同部位的成纖維細胞存在異質(zhì)性¹。

3. Age-Dependent Change in Cardiomyocyte Signatures

前面的結(jié)果提示隨著年齡增長，心肌細胞（核）的比例逐漸下降（Fig 1D）。前面看了成纖維的異質(zhì)性，這部分也看一看心肌細胞的異質(zhì)性。

Fig 5A：甜甜圈圖展示了三組sample的各類細胞的uniquely upregulated genes。group <1 of age的差異基因中，心肌細胞的差異基因最多。在另外兩組中，心肌細胞的差異基因占比沒有這么大。

這樣展示差異基因也挺好玩的，讓我想起單細胞測序揭示心衰患者循環(huán)免疫細胞的廣泛變化這篇文章的Fig 1I，用韋恩圖看哪類細胞群貢獻了更多的差異基因。

Fig 5B：和Fig3一樣，給幾個心肌細胞群做了monocle2，分為5個state。
Fig 5C：State 3的心肌主要在<1歲的患者中存在。State 1和State 5的心肌主要在12-13歲患者中存在。
Fig 5D：State3和State1的擬時差異基因
Fig 5E：State1，State 5和State3的擬時基因的富集結(jié)果。State 1和State 5主要富集到血管生成，內(nèi)皮細胞分化，細胞外基質(zhì)形成以及肌肉收縮，局部粘附和細胞死亡相關(guān)的通路，State3的基因富集到肌肉收縮和發(fā)育的通路。

Fig 5

Fig 6A B：前面說State 3的心肌主要在<1歲的患者中存在，A的熱圖顯示了心肌細胞State 3的top高表達基因。 其中包括cyclin D (CCND2)和ERBB2這兩個細胞周期調(diào)節(jié)基因，提示<1y的心肌仍然存在高度分化潛能。
Fig 6C：免疫熒光驗證了CCND2的表達
Fig 6 D：和成纖維一樣，在幼年和成年小鼠心肌細胞中檢測了這兩個基因的表達，也出現(xiàn)了下降。
Fig 6 E F：State 3 (<1歲) 的心肌細胞中還存在代謝基因表達譜。表現(xiàn)為高表達糖酵解基因和相對低表達脂肪酸代謝基因。
Fig 6 G：其他State 3 (<1歲) 的心肌富集到的基因包括細胞周期調(diào)節(jié)基因BTG。
Fig 6 H：免疫熒光驗證BTG的下調(diào)
Fig 6 I：在幼年和成年小鼠心肌細胞中驗證BTG的表達下降。
Fig 6 J：此外作者還觀測到不同年齡患者的心肌細胞存在肌球蛋白亞型從MYH6向MYH7的轉(zhuǎn)變。（這個發(fā)現(xiàn)也不surprising啊，之前就報道過的。見下圖）

Circulation Research. 2020;126:1086–1106

Fig 6

4. Changes in Cardiomyocyte β-Adrenergic Signaling Transcriptomes

因為β-AR信號通路在成年HF患者中是異常的，而且有研究報道兒童DCM和成人相比β-ARs表達更低。

Figure VIa：作者在心肌細胞的5個state中查看了ADRB1和ADRB2（β1- and β2-ARs）隨著擬時間軸的變化。結(jié)果提示兩個基因都有下降趨勢，但是ADRB1:ADRB2的比例沒有變化 (4.11 in
infants; 4.44 in children 12–13 years of age)
Figure VIb：但是作者關(guān)注到了顯著的下游信號通路的表達變化，表現(xiàn)為和infant心臟相比，older的DCM患者β-adrenergic Gs信號通路的下調(diào)和maladaptive β2 Gi下游信號通路的上調(diào)。

Figure VI

參考文獻：

1. Anatomically distinct fibroblast subsets determine skin autoimmune patterns