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自從二代測序技術出現，把一次實驗測許多條DNA序列的這個難題解決之后，一次把一個人的全基因組給測出來，最極限的情況，就是樣本量就是少到一個細胞，就要測出整個基因組的序列信息。

三個難題

要實現從一個細胞樣本測出全基因組的DNA序列，至少要克服以下3個難題：

• 第1個難題，就是如何實現均勻擴增，用傳統的隨機引物PCR的方法來擴增不同擴增片段的擴增效率多少會有一些差異，這些擴增效率的差異會隨著擴增循環數的增加，呈現出指數放大的效果。其結果就是會發生嚴重的覆蓋不均一，極少數區段的DNA被大量擴增，測序后它深度非常深，但在大多數區段只有很低的覆蓋，甚至沒有覆蓋。那么我們就無法有效地判斷那些低擴增效率區段的基因序列的情況。

• 第2個難題，就是 全基因組覆蓋問題。常規的、用大量DNA進行建庫的方法，因為打斷、補平、加A、加接頭等一長串的操作，每一步都會有DNA片段的損失。結果就是初始DNA中很大一部分會被浪費掉，而沒有形成有效的文庫分子。

在單細胞測序中，丟失大部分的起始DNA，是不可接受的。單細胞測序要求幾乎所有的原始基因組片段都得到擴增，并且在后續的測序過程中被測序測到。這就要求幾乎所有的片段，都會被得到擴增，而不只是少數片段得到有效擴增。

• 第3個難題，是這種方法要有較高的擴增效率。建好的文庫，在HiSeq測序儀上機的時侯，大約每上機2萬個文庫分子，只有1個文庫分子，是能夠在測序的Flowcell表面生成簇，并且被測序測到的，剩下的大多數文庫分子，在上機的時侯是被水沖走的。所以，單細胞基因組擴增的方法，還要有較高的擴增效率。至少要有上萬倍到幾十萬倍的擴增效率，才能保證在全基因組測序的時侯，大部分的片段都被測序測到。

兩種方法

為了解決上述的難題，科學家想了許多的辦法。到目前為止，大家比較認可的方法有兩種：第一種是MALBAC方法。第二種是MDA方法。

- MALBAC方法

我們先來說這個MALBAC方法。它的全稱是：MultipleAnnealing and Looping-Based Amplification Cycles。是謝曉亮教授發明的方法

這張圖是MALBAC方法的示意圖。這個黑色的線條，就是基因組模板DNA，這些紅顏色的線條就是擴增引物，擴增引物的5’端有27個堿基的通用序列，這些通用序列會作為未來的PCR通用擴增引物的結合序列。擴增引物的3’端有8個隨機序列的堿基，這8個堿基可以隨機地雜交到基因組DNA的互補序列上。

這些灰色的橢園是Phi 29 DNA聚合酶，Phi 29 DNA聚合酶有一個特點，它不僅可以生成新的DNA鏈，它還能把之前已經合成好的DNA鏈給解鏈開。

再形成自己的新鏈，這個特點能夠把每個循環所能合成的DNA新鏈的數量提高幾倍、甚至幾十倍、上百倍。接下來，就是做5個MALBAC循環，請注意，這里每個循環的最后一步是58度退火。我們后面要詳細解釋這一步58度退火的作用。

第一個循環下來，得到的是一批5’端有通用擴增序列的DNA片段。

在第二個循環完成后，所產生的擴增產物中，大部分是5’端有通用序列。而3’端，有與通用序列互補的序列的這些片段。

圖中的這4個步驟，一共重復5次，這樣做的巧妙之處，就是要解決我們剛才所說的3個難題。

第一、是要均勻擴增
第二、是要全基因組覆蓋
第三、是要有高的擴增效率

這個MALBAC方法的巧妙之處，就是在每個循環的最后，加了一步58度退火，這一退火過程，它讓完整擴增的產物，它的兩端發生鏈內雜交。這樣，3’端的序列就不能與新的、游離的引物發生雜交。這也就不會引新的、發起始于3’端的擴增，這樣，就避免了完整擴整的產物的自我指數擴增。

現在，還是8個隨機序列的引物在模板上隨機地找結合位置，所有的位點都有一樣的機會被擴增。那么，這樣實際得到的產物分2種：

• 第1種，就是m* n 個“完整擴增產物”，這是最主要的產物。這里“m”就是循環的次數， “n”是一個循環中，有多少個擴增，引物可以粘到一個模板上。

• 第2種擴增產物，就是(m+1)* n個“半擴增產物”，第3種DNA，就是那個原始的DNA模板，這里完整產物的數量是“m*n ”，也就是說，擴增產物（的數量）與擴增的循環次數“m”成正比，而不是與m的平方成正比。更不是與2 的M次方成正比。

這也就是達到了，我們想要的“線性擴增”的目的。也就是說擴增產物（的數量）與擴增的次數成線性關系。這就達成了我們單細胞測序當中第1個要求“線性擴增”。

再利用Phi 29聚合酶的能一次在模板上聚合出多個新鏈的功能來解決“全基因組覆蓋”。

在5輪的擴增之后，每個模板都會有5*n^2個擴增片段。這樣，就可以保證建庫時大多數的基因組區域可以被建成文庫，最后，可以被（測序）測到。

第3個要解決“高效率擴增”。還是利用了這個Phi 29酶的一次得到多個擴增片段的這個效果，來達成的。

上面所說的，就是MALBAC單細胞擴增技術的基本原理、和它的巧妙之處.

- MDA方法

目前市場上還有一種單細胞的擴增技術，叫MDA擴增技術。它的全稱是MultipleDisplacement Amplification。MDA方法的技術核心是用Phi 29 DNA聚合酶來進行直接的擴增。

Phi 29酶的特點是，它可以把雙鏈DNA進行解鏈，然后，在常溫條件下，就把原始模板進行大量擴增。

- 兩種方法的比較

把MDA和MALBAC兩種方法進行比較

MDA的優勢在于，它的擴增效率更高，并且，實驗方法更簡單。

MALBAC方法的特點，在于它的擴增均一性更好。但是，它得到的擴增DNA量相對較少，或者說，它的擴增效率相對比較低。

這張圖是：大量細胞測序、MDA方法測序、MALBAC方法測序，這三種測序結果的Lorenz曲線。Lorenz曲線是越接近于對角線，則覆蓋越均一，從圖中，我們可以看出大量細胞測序，它的均一性是最好的。用MALBAC方法測序，它的均一性比大量細胞測序的均一性要差一些，但是要比MDA的方法的均一度要好。

這張圖是用三種方法來測腫瘤細胞中的拷貝數變異。其中橫軸是染色體的序列，縱軸是測序的覆蓋深度，可以明顯地看到，在大量細胞測序的結果中，可以非常直觀地看到拷貝數變異的情況。

而用MALBAC的方法，也還是能夠比較清楚地看到拷貝數變異。但是，它沒有大量細胞測序的結果那么清楚。而用MDA的方法來看拷貝數變異，則不是那么容易看清楚。

- 臨床應用

單細胞測序，有著廣泛的應用前景。目前最主要2個應用：

• 1.是在胚胎植入前進行基因拷貝數變異檢測。

• 2.是進行腫瘤的染色體變異研究。

在這里我們介紹一下，單細胞測序在胚胎植入前檢測中的應用，在有習慣性流產的夫婦當中，最常見的病因就是染色體的平衡易位，所謂染色體平衡易位，也就是A染色體，的一段移到了B染色體上。

如果夫妻一方有染色體平衡易位，那么這對夫婦的受精卵中，每4個受精卵，可能只有1個是正常的。剩下3個（不正常的受精卵），很可能會流產。要把這一個正常的受精卵挑出來，目前，最有效的解決手段是做受精卵植入前檢測。

那么具體的操作方法，就是先做人工受精。在受精卵發育到8個細胞的時侯，通過顯微操作，抓一個細胞出來進行測序。在這個測序過程當中，就要用到MDA方法或MALBAC方法進行擴增、建庫、測序。然后測序完成之后，挑出那個好的受精卵，植回到母親的子宮中去。長成一個正常的新生兒。這個，就是受精卵植入前基因檢測。這項技術，是對生殖健康有很大幫助的一項新技術。

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