DNA甲基化測序數據處理(一):數據比對

前言

因為組里面出了一批甲基化測序數據,使用的技術為BS-seq,處理的時候順帶記錄了學習過程,演示使用數據為官方提供的example.fastq。

DNA甲基化及CpG島定義了解

DNA甲基化(英語:DNA methylation)為DNA化學修飾的一種形式,能在不改變DNA序列的前提下,改變遺傳表現。為外遺傳編碼(epigenetic code)的一部分,是一種外遺傳機制。DNA甲基化過程會使甲基添加到DNA分子上,例如在胞嘧啶環的5'碳上:這種5'方向的DNA甲基化方式可見于所有脊椎動物。
人類細胞內,大約有1%的DNA堿基受到了甲基化。在成熟體細胞組織中,DNA甲基化一般發生于CpG雙核苷酸(CpG dinucleotide)部位;而非CpG甲基化則于胚胎干細胞中較為常見[1] [2]。植物體內胞嘧啶的甲基化則可分為對稱的CpG(或CpNpG),或是不對稱的CpNpNp形式(C與G是堿基;p是磷酸根;N指的是任意的核苷酸)。
特定胞嘧碇受甲基化的情形,可利用亞硫酸鹽定序(bisulfite sequencing)方式測定。DNA甲基化可能使基因沉默化,進而使其失去功能。此外,也有一些生物體內不存在DNA甲基化作用。
——維基百科

DNA甲基化作為基因組上的表觀修飾(區別于組蛋白修飾),存在于各種生物中。

簡單來說,可以認為甲基化代表著基因的失活,去甲基化則標志基因的激活與表達

雖然CpG序列出現的頻率并不高,但是在某些基因區域內,CpG的密度很高,俗稱CpG島。這些CpG島大多出現在基因的啟動子區域(人類占到70%),長度達300-3000bp。目前的研究表明,大多數的管家基因都含有CpG島,位于基因的5'端(其中的大多數CpG島都是未甲基化的)。

另外需要注意的是,目前的研究表明,腫瘤樣本與正常樣本的CpG島甲基化差異大多不是發生CpG島的內部而是位于CpG島岸(CpG island shore)

由于CpG位點的易甲基化導致胞嘧啶脫氨變成胸腺嘧啶,所以在漫長的進化過程中,CpG位點逐漸消失,但是又存在著對于基因表達的調控要求,所以CpG島的出現也被理解為抵抗甲基化經常很,維持調控功能。

DNA甲基化測序原理與方法

此處略過,請自行了解(示例文件為WGBS單端測序文件)。

其實是因為理解起來比較累,知道大致原理就可以了,以后再來填坑

數據處理(使用Bismark軟件處理)

Bismark下載

Bismark官網

The less the people know about how sausages and our code are made, the better they sleep at night (untracable author)
bismark_v0.19.0.tar.gz
解壓即用tar xzf bismark_v0.X.Y.tar.gz,常用的話將路徑寫入PATH:PATH=/PATH/TO/Bismark/:$PATH
manual頁面需要搭梯子才能看到,簡書不支持附件,所以有需要的可以留言,我email pdf文件

Dependencies

需要用戶已經裝好bowtie1/bowtie2

測試數據獲取

此處使用測試數據test.fastq
(from SRR020138, Lister et al., 2009; trimmed to 50 bp; base call qualities are Sanger encoded Phred values (Phred33)).

$ls -l
total 2.1M
-rw-r--r-- 1 sxj users 2.1M Apr 17  2018 test_data.fastq

INDEX文件構建

# under install folder
./bismark_genome_preparation --path_to_bowtie /PATH/to/bowtie2/ --verbose ~/PATH/to/GRCh38/

比對

# paired-end data
./bismark --genome ~/PATH/to/GRCh38/ -1 read1.fastq.gz -2 read2.fastq.gz -p 4 -o ./ 2>test.log

# single-end data
./bismark --genome ~/PATH/to/GRCh38/ test_data.fastq -p 4 -o ./ 2>test.log

甲基化位點提取

./bismark_methylation_extractor -s --gzip --bedGraph --buffer_size 10G --cytosine_report --comprehensive --genome_folder ~/PATH/to/GRCh38/ test_data_bismark_bt2.bam 2>extracor.log

生成處理報告

./bismark2report

所有結果文件

ls -l
-rw-r--r-- 1 sxj users  82K Apr 18 16:11 CHG_context_test_data_bismark_bt2.deduplicated.txt.gz
-rw-r--r-- 1 sxj users 154K Apr 18 16:11 CHH_context_test_data_bismark_bt2.deduplicated.txt.gz
-rw-r--r-- 1 sxj users 138K Apr 18 16:11 CpG_context_test_data_bismark_bt2.deduplicated.txt.gz
-rw-r--r-- 1 sxj users 105K Apr 18 17:30 extracor.log
-rw------- 1 sxj users  20K Apr 17 15:56 nohup.out
-rw-r--r-- 1 sxj users 450K Apr 17 15:56 test_data_bismark_bt2.bam
-rw-r--r-- 1 sxj users 449K Apr 18 10:34 test_data_bismark_bt2.deduplicated.bam
-rw-r--r-- 1 sxj users  48K Apr 18 16:11 test_data_bismark_bt2.deduplicated.bedGraph
-rw-r--r-- 1 sxj users  55K Apr 18 16:11 test_data_bismark_bt2.deduplicated.bismark.cov
-rw-r--r-- 1 sxj users 217M Apr 18 17:30 test_data_bismark_bt2.deduplicated.CpG_report.txt.CpG_report.txt.gz
-rw-r--r-- 1 sxj users 2.9K Apr 18 16:11 test_data_bismark_bt2.deduplicated.M-bias.txt
-rw-r--r-- 1 sxj users  766 Apr 18 16:11 test_data_bismark_bt2.deduplicated_splitting_report.txt
-rw-r--r-- 1 sxj users  260 Apr 18 10:34 test_data_bismark_bt2.deduplication_report.txt
-rw-r--r-- 1 sxj users 347K Apr 19 23:18 test_data_bismark_bt2_SE_report.html
-rw-r--r-- 1 sxj users 1.8K Apr 17 15:56 test_data_bismark_bt2_SE_report.txt
-rw-r--r-- 1 sxj users 2.1M Apr 17 15:14 test_data.fastq
-rw-r--r-- 1 sxj users 6.2K Apr 17 15:56 text.log

結果解讀

--cytosine_report參數會根據當前目錄下的信息文件生成一個HTML格式的報告文件,即test_data_bismark_bt2_SE_report.html文件,它包括了比對信息,甲基化信息,M-bias等,可以對數據有一個大概的認知(下圖只展示了一部分):

比對信息

M-bias

同時因為使用了--comprehensive,所以結果合并正反鏈的數據后會輸出CpG/CHG/CHH三種類型的甲基化文件,包含了胞嘧啶所有的組合形式,但實際上我們自然最關注的是CpG位點的甲基化。其中

CpG_context_test_data_bismark_bt2.deduplicated.txt即CpG甲基化位點的文件。

head CpG_context_test_data_bismark_bt2.deduplicated.txt

Bismark methylation extractor version v0.19.0
SRR020138.15024317_SALK_2029:7:100:1672:902_length=86   -   1   57333019    z
SRR020138.15024319_SALK_2029:7:100:1672:31_length=86    +   2   10026473    Z
SRR020138.15024331_SALK_2029:7:100:1673:1282_length=86  +   11  78025243    Z
SRR020138.15024343_SALK_2029:7:100:1673:202_length=86   +   10  121617231   Z
SRR020138.15024357_SALK_2029:7:100:1673:879_length=86   -   4   75173715    z
SRR020138.15024361_SALK_2029:7:100:1673:235_length=86   -   2   130768889   z
SRR020138.15024368_SALK_2029:7:100:1673:123_length=86   +   10  106402850   Z
SRR020138.15024376_SALK_2029:7:100:1673:1908_length=86  -   12  124097382   z
SRR020138.15024380_SALK_2029:7:100:1673:397_length=86   +   8   95038627    Z
# 第一列為測序信息
# 第二列為甲基化狀態 + 代表甲基化 -代表未甲基化
# 第三列代表chromosome
# 第四列代表location
# 第五列代表methylation call,簡單來說大寫的就是甲基化的(因為還有CHG,CHH的數據,分別對應x, X , h, H)

test_data_bismark_bt2.deduplicated.bismark.cov文件則給了每個位點的甲基化比例,為下一步確定CpG島提供了基礎,其數據形式如下:

$head test_data_bismark_bt2.deduplicated.bismark.cov
1   975476  975476  100 1   0
1   975488  975488  100 1   0
1   975490  975490  100 1   0
1   2224487 2224487 100 1   0
1   2224489 2224489 100 1   0
1   2224514 2224514 100 1   0
1   2224520 2224520 100 1   0
1   2313220 2313220 0   0   1
1   9313902 9313902 100 1   0
1   9313914 9313914 100 1   0

# 第一列代表chromosome
# 第二,三列代表location
# 第四列代表甲基化百分比
# 第五列代表甲基化數目
# 第六列代表未甲基化數目

test_data_bismark_bt2.deduplicated.CpG_report.txt.CpG_report.txt文件則是背景信息:

$head test_data_bismark_bt2.deduplicated.CpG_report.txt.CpG_report.txt
1   10469   +   0   0   CG  CGC
1   10470   -   0   0   CG  CGA
1   10471   +   0   0   CG  CGG
1   10472   -   0   0   CG  CGC
1   10484   +   0   0   CG  CGG
1   10485   -   0   0   CG  CGG
1   10489   +   0   0   CG  CGC
1   10490   -   0   0   CG  CGG
1   10493   +   0   0   CG  CGC
1   10494   -   0   0   CG  CGG

# 第一列為chromosome
# 第二列為location
# 第三列為strand
# 第四,五列為甲基化和非甲基化的堿基數目
# 第六列為CG
# 第七列為背景(第一個C延伸兩個堿基)

其它參數

bam2nuc
bismark2summary
coverage2cytosine
NOMe_filtering
filter_non_conversion
# 有需要的可以自信探索 --help or manual

結語

此處根據測序數據得到了甲基化位點的信息,但是后續DML以及DMR的確定還需要R包的使用,以及后續的可視化還以探索以下包:


挖坑待填

Methy-Pipe: An Integrated Bioinformatics Pipeline for Whole Genome Bisulfite Sequencing Data Analysis
2014年出的一個pipeline,分析作圖一條龍,有興趣的同學安排一下。

最后編輯于
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