01? 內(nèi)容

腫瘤微環(huán)境是指腫瘤的發(fā)生、生長及轉(zhuǎn)移與腫瘤細胞所處的內(nèi)外環(huán)境有著密切關(guān)系，它不僅包括腫瘤所在組織的結(jié)構(gòu)、功能和代謝，而且亦與腫瘤細胞自身的(核和胞質(zhì))內(nèi)在環(huán)境有關(guān)。腫瘤與環(huán)境，兩者既是相互依存，相互促進，又是相互拮抗，相互斗爭的。它是現(xiàn)代腫瘤生物學(xué)的一個關(guān)鍵和核心的問題。近年來由于腫瘤細胞學(xué)和分子生物學(xué)的進展，人們對于腫瘤和環(huán)境的相互關(guān)系有了更加深入的了解。這不僅對于認識腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等有著重要的意義，而且對于腫瘤的診斷、防治和預(yù)后亦有著重要的作用。今天為大家?guī)硪黄?020年發(fā)表于JEM（The Journal of Experimental Medicine）的文章：Accumulation of long-chain fatty acids in the tumor microenvironment drives dysfunction in intrapancreatic CD8+ T cells，探討代謝物對于研究腫瘤微環(huán)境的意義。

02? 文章速讀

CD8+ T細胞是抗腫瘤免疫的主效應(yīng)因子，它們在腫瘤部位的存在與良好的結(jié)果相關(guān)。然而，腫瘤微環(huán)境(TME)所施加的代謝約束會抑制它們控制腫瘤進展的能力。文章描述了在胰腺導(dǎo)管腺癌(PDA)的TME區(qū)脂質(zhì)聚集，CD8+ T細胞浸潤小鼠和人類腫瘤。在這種富含脂質(zhì)但缺乏營養(yǎng)的TME中，利用脂質(zhì)代謝對維持細胞功能尤為重要。

本研究發(fā)現(xiàn)，胰腺內(nèi)CD8+ T細胞逐漸積累特定的長鏈脂肪酸(LCFAs)，而不是提供燃料來源，這損害了它們的線粒體功能，并觸發(fā)脂質(zhì)代謝途徑的主要轉(zhuǎn)錄重編程，從而導(dǎo)致脂肪酸分解代謝的減少。特別是，胰腺內(nèi)CD8+ T細胞特異性地表現(xiàn)出極長鏈酰輔酶A脫氫酶(VLCAD)的下調(diào)，這加劇了介導(dǎo)脂肪毒性的極長鏈脂肪酸(VLCFAs)和極長鏈脂肪酸(VLCFAs)的積累。通過ACADVL的強制表達，腫瘤特異性T細胞的代謝重編程能夠增強腫瘤內(nèi)T細胞的存活和持久性，克服了PDA免疫治療的一個主要障礙。

03? 文章背景

1.胰管腺癌（PDA）患者的總體生存率似乎與CD8+T細胞浸潤有關(guān)，但我們對調(diào)節(jié)這些浸潤T細胞在腫瘤微環(huán)境(TME)背景下功能的機制的認識仍然有限。

2.CD8+T細胞是抗腫瘤免疫的關(guān)鍵效應(yīng)因子。然而，腫瘤浸潤的CD8+T細胞往往獲得被稱為“衰竭”的分化狀態(tài)的改變，因此無法控制腫瘤的生長。在PDA患者和PDA的小鼠模型中的幾項研究表明，CD8T細胞往往很少，如果存在，則會變得功能失調(diào)。

3.最近的發(fā)現(xiàn)表明CD8+T細胞的激活和分化與代謝重編程密切相關(guān)。恢復(fù)CD8+T細胞依賴氧化磷酸化(OXPHOS)來促進其代謝需求。

4.腫瘤細胞具有高度的糖酵解，并通過消耗大量關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)，特別是葡萄糖來支持其過度生長，這也是最佳T細胞激活所必需的。當缺乏葡萄糖時，CD8+T細胞產(chǎn)生效應(yīng)細胞因子的能力受到損害。然而，它們?nèi)匀豢梢酝ㄟ^線粒體OXPHOS維持其增殖和效應(yīng)功能，使用長鏈脂肪酸(LCFAs)通過脂肪酸(FA)β氧化過程來促進三羧酸循環(huán)。

5.目前尚不清楚腫瘤微環(huán)境（TME）的營養(yǎng)成分變化如何與觀察到的腫瘤浸潤CD8+T細胞功能障礙相關(guān)。

6.現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，腫瘤特異性CD8+T細胞的代謝重編程可能是促進代謝敵對TME存活的策略，作為提高免疫治療臨床療效的方法的一部分。

04? 方法技術(shù)

1.免疫組化

2.免疫熒光

3.T細胞分離

4.透射電鏡

5.油紅O脂質(zhì)染色

6.葡萄糖濃度測定

7.細胞外通量分析

8.流式細胞分選

9.小鼠靜脈給藥

10.T細胞脂質(zhì)組學(xué)分析液相色譜

11.細胞轉(zhuǎn)錄組分析

12.質(zhì)譜成像

13.小鼠T細胞TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)

14.過繼性免疫療法

15.超聲成像

16.單細胞測序

實驗結(jié)果

1.胰腺TME在PDA進展過程中積累脂質(zhì)

（1）脂質(zhì)在PDA TME中積累，而葡萄糖和H6Ps在PDA進展過程中減少

在9 - 30周的不同時間點處死小鼠，根據(jù)細胞學(xué)和結(jié)構(gòu)異常，將腫瘤發(fā)展分為早期胰腺上皮內(nèi)瘤變和高級別瘤前病變。中性脂質(zhì)從早期到晚期的發(fā)展過程中在胰腺組織中積累。通過k-means聚類對數(shù)據(jù)進行分割，并將IMS與共聚焦圖像進行共配，得到一個平均譜，并與連續(xù)切片上的CD8+ T細胞分布呈正相關(guān)。

（2）中性脂質(zhì)和LC甘油磷脂在PDA進展過程中積累在TME中

在CD8T細胞填充的區(qū)域（其中一個以橙色突出顯示）的進展過程中發(fā)現(xiàn)一個具有代表性的脂質(zhì)物種PE（42：6）(一種多不飽和磷脂酰乙醇胺，總碳FA鏈長度為42個碳)富集。研究表明，在浸潤CD8+T細胞的地區(qū)，含有非常長鏈FAs(VLCFAs)的特定甘油磷脂在胰腺上皮內(nèi)瘤變中富集。結(jié)果主要檢測到PEs和磷脂酰肌醇的增加，特定物種的富集在早期病變中已經(jīng)明顯。磷脂酰絲氨酸和磷脂酰膽堿的差異不太明顯。與對照相比，非常長鏈(VLC)鞘磷脂在晚期疾病時間點相對減少。

2.CD8+T細胞在PDA進展過程中功能受損

用免疫組織化學(xué)方法對T細胞在原位的浸潤進行了縱向分析，發(fā)現(xiàn)這兩個CD4+和CD8+T細胞在疾病早期滲透到胰腺，并持續(xù)到后期。浸潤胰腺組織的免疫細胞的流式細胞術(shù)分析表明，總CD3+T細胞的百分比在炎癥早期達到峰值，并在高級別病變中保持相似的頻率。根據(jù)先前的研究，在CD3T細胞中，F(xiàn)oxp3調(diào)節(jié)性T細胞的絕對數(shù)量和CD4T細胞總數(shù)的百分比增加。相反，兩個絕對數(shù)和頻率隨著時間的推移，CD8+T細胞明顯下降，而它們逐漸獲得功能衰竭的特征，這是由耗竭標記的上調(diào)所表明的，包括PD1和TIM3和降低產(chǎn)生效應(yīng)細胞因子和分子的能力，如IFNγ和顆粒酶β。因此，PDA能夠招募初始CD8+T細胞免疫反應(yīng)，但CD8+T細胞在腫瘤進展過程中功能受損。

3.胰腺內(nèi)CD8+T細胞積累VLCFAs，CD8+T細胞功能障礙與特定LCFAs的積累有關(guān)

（1）胰腺內(nèi)CD8+T細胞積累VLCFAs

早期和晚期胰腺上皮內(nèi)瘤變浸潤CD8+T細胞明顯高于對照脾。對CD8+T細胞脂質(zhì)表達譜表明，在早期時間點，浸潤的CD8+T細胞的脂質(zhì)組成已經(jīng)與幼稚細胞顯著不同。比較CD8+和CD4+T細胞浸潤晚期胰腺上皮內(nèi)瘤變的脂質(zhì)組成譜，觀察到除甘油磷脂外，所有超級水平的脂質(zhì)的總體增加，它們是細胞膜的主要結(jié)構(gòu)成分。在晚期時間點發(fā)現(xiàn)不同的FAs富集。在從晚期胰腺上皮內(nèi)瘤變分離的CD8+T細胞中積累的FAs列表中發(fā)現(xiàn)棕櫚酰胺，在BSA-棕櫚酸存在下培養(yǎng)CD8+T細胞，發(fā)現(xiàn)棕櫚減少增殖和分泌效應(yīng)分子的能力，如IFNγ、顆粒酶β和TNF-α。

（2）VLCFA在胰腺內(nèi)CD8T細胞積累

熒光葡萄糖類似物2-[N-(7-硝基苯-2-oxa-1，3-二唑-4-yl)氨基]-2-脫氧-D-葡萄糖(2-NBDG)的攝取在CD8+T細胞亞群中具有可比性。從早期和晚期，胰腺上皮內(nèi)瘤在其膜上表達CD36，與通過浸潤CD8T細胞增加LC脂質(zhì)攝取一致的。觀察到在CD4+T細胞和總CD45+CD3-髓系細胞中，Bodipy-C16的攝取也高于脾細胞，提示了一種免疫細胞浸潤胰腺TME的一般機制，通過試圖從葡萄糖轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)代謝來適應(yīng)其獨特的營養(yǎng)成分。脾幼稚T細胞和浸潤CD8+T細胞的早期和晚期胰腺上皮內(nèi)瘤變具有不同的代謝譜。與早期相比，浸潤晚期胰腺上皮內(nèi)瘤變的CD8+T細胞表現(xiàn)出更明顯的組成變化。特別是，在疾病進展的時間過程中，對統(tǒng)計上不同的脂質(zhì)代謝化合物的注釋證實了浸潤的CD8+T細胞中脂質(zhì)的總體增加，這在晚期胰腺上皮內(nèi)瘤變中更明顯地表現(xiàn)在FAs的超類水平上。共享相同TME的浸潤CD4+T細胞在早期和晚期胰腺上皮內(nèi)瘤變中表現(xiàn)出最小的差異，與CD8+T細胞不同，CD4+T細胞在腫瘤進展過程中沒有經(jīng)歷主要的脂質(zhì)積累。檢測CD8+T細胞在腫瘤進展過程中在體內(nèi)形成LDs的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)即使>20%浸潤早期病變的CD8+T細胞中含有LD，但在晚期時間點，這一顯著降低。

4.胰內(nèi)CD8+T細胞在富含脂質(zhì)的PDA TME中代謝耗盡

通過觀察棕櫚酸對其線粒體功能的影響，發(fā)現(xiàn)棕櫚酸處理的CD8+T細胞顯示線粒體功能下降。相反，亞油酸治療不會引起任何線粒體功能障礙。浸潤晚期胰腺上皮內(nèi)瘤變的CD8+T細胞表現(xiàn)出較高的線粒體頻率，有不規(guī)則的嵴和擴張的腕間間隙（腫脹），以及具有明顯電子致密基質(zhì)的高凝結(jié)線粒體，通常存在于凋亡前細胞中，且線粒體質(zhì)量下降。在積累BodipyFLC16的CD8+T細胞中，線粒體染色僅在棕櫚處理后顯著降低，CD8+T細胞積累中性脂質(zhì)(脂質(zhì)TOX)即使在棕櫚處理時也沒有表現(xiàn)出類似的線粒體缺陷。FACS分析顯示，與CD4室相比，CD8室的Bodipy FL C16陽性細胞和MitoTracker陰性細胞的頻率明顯升高。結(jié)果表明，雖然大多數(shù)CD4+T細胞能耐受LC脂質(zhì)的攝取，但吸收LC脂質(zhì)的CD8+T細胞中有很大一部分具有受損的線粒體。在比較CD8+T細胞與髓系細胞室(CD45+CD3?時)，也得到了類似的結(jié)果,提示脂質(zhì)積累和線粒體功能障礙可在浸潤的CD8T細胞中特異性地交織在一起。與幼稚T細胞相比，CD3/CD28結(jié)扎激活后OCR顯著增加，但優(yōu)先使用有氧糖酵解。相反，OXPHOS對早期浸潤CD8和CD4T細胞至關(guān)重要，可能是一種滿足在腫瘤內(nèi)發(fā)揮其功能所必需的高代謝需求的手段。然而，CD8+T細胞逐漸失去了參與OXPHOS的能力，在晚期時間點與早期胰腺上皮內(nèi)瘤變細胞相比。相反，浸潤的CD4+T細胞在腫瘤進展過程中增加了OCR率。

5.浸潤晚期腺上皮內(nèi)瘤變的CD8+T細胞顯示ACADVL下調(diào)

（1）胰腺內(nèi)CD8+T細胞從早期和晚期病變是轉(zhuǎn)錄不同的

RNA測序突出了與早期和晚期腺上皮內(nèi)瘤變相關(guān)的不同特征。差異調(diào)節(jié)基因在不同的T細胞群體中表現(xiàn)出改變的代謝特征，包括與FA穩(wěn)態(tài)相關(guān)的基因亞群。與靜息的幼稚T細胞相比，活化的CD8+T細胞對檢測基因的很大一部分(n=58)有差異調(diào)節(jié)作用。然而，Palm存在下的激活大大改變了它們的轉(zhuǎn)錄譜，特別是參與FA代謝的基因。ACADVL在LCFA處理的細胞中與對照相比明顯下調(diào)，證實其表達與LCFA積累密切相關(guān)。

（2）浸潤晚期腺上皮內(nèi)瘤變的CD8+T細胞ACADVL缺乏

從晚期腺上皮內(nèi)瘤變中分離到的浸潤的CD8+T細胞與從早期腺上皮內(nèi)瘤變中分離出來的CD8+T細胞轉(zhuǎn)錄不同，晚期病變分離的細胞表現(xiàn)為參與細胞介導(dǎo)的細胞毒性和線粒體功能(Ndufa3、Ndufa9、Ndufa11和Vdac3)的關(guān)鍵基因下調(diào)。分析證實，CD8+T細胞在浸潤晚期腺上皮內(nèi)瘤變時，VLC酰輔酶A脫氫酶(VLCAD)水平低于早期。相反，在相同的富含脂質(zhì)的TME中，CD4+T細胞上調(diào)了VLCAD的水平，與它們接觸OXPHOS和適應(yīng)不斷變化的TME的能力相一致。

6.腫瘤特異性T細胞工程表達更高水平的ACADVL表現(xiàn)出增強的代謝適應(yīng)能力

（1）用于表達ACADVL的腫瘤特異性T細胞具有更好的代謝適應(yīng)能力

用一個含有TCR1045單獨或TCR1045和ACADVL的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)導(dǎo)CD8+T細胞，該結(jié)構(gòu)由P2A元件連接。與TCR1045單獨相比，ACADVL在Msln特異性T細胞中的過表達導(dǎo)致ACADVL-TCR1045轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞酶活性升高，過表達ACADVL的T細胞線粒體功能較高。ACADVL-TCR1045細胞基底OCR和備用呼吸能力升高。監(jiān)測KPC小鼠，直到發(fā)育一個定義的胰腺腫瘤腫塊，然后再進行相同數(shù)量的TCR1045和ACADVL-TCR1045T細胞，表達不同的同源標記，以方便跟蹤每一個群體的工程T細胞隨時間在同一個治療宿主在同一個TME。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在輸注后10d，ACADVL-TCR1045T細胞在腫瘤中的數(shù)量明顯高于TCR1045T細胞，表現(xiàn)出較好的T細胞代謝適應(yīng)度和生存優(yōu)勢。在輸注后21d，ACADVL-TCR1045T細胞的這種優(yōu)先存活更加明顯，表明表達ACADVL的T細胞在代謝敵對的TME中提高了存活和持久性。

（2）ACADVL過表達增強了代謝適應(yīng)能力

轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細胞表達工程TCR(Vβ9)和結(jié)合的H2-Db四聚體，即MHCI等位基因，含有Msln406-414。體外刺激和轉(zhuǎn)導(dǎo)7d后，兩種細胞類型均表達類似的激活標記CD69和4-1BB，并產(chǎn)生類似數(shù)量的抗腫瘤細胞因子IFNγ和TNFα，以響應(yīng)刺激同源MSln406-414肽。在輸注后21d，ACADVL-TCR1045T細胞的這種優(yōu)先存活更加明顯，表明表達ACADVL的T細胞在代謝敵對的TME中提高了存活和持久性。相對于TCR1045T細胞，在脾臟和血液中也發(fā)現(xiàn)了更多的ACADVL-TCR1045T細胞。注射后10d，ACADVL-TCR1045T細胞僅表達低水平的PD-1、Tim-3、Lag-3和TIGIT，與報道的TCR1045T細胞相似。在轉(zhuǎn)移后10d從腫瘤中分離出的兩個T細胞群體與脾對應(yīng)物相比，減少產(chǎn)生IFNγ和TNFα，但相互之間的細胞因子數(shù)量相似。

7.人胰腺內(nèi)CD8+T細胞下調(diào)人脂質(zhì)豐富的TME中ACADVL

（1）人CD8+T細胞浸潤PDA的脂質(zhì)積累和ACADVL功能障礙

評估七對匹配的人類PDA和鄰近的正常組織，紅油O染色證實了人PDA腫瘤積累中性脂質(zhì)的趨勢。與小鼠樣本一樣，人樣本中VLC鞘磷脂相對減少。轉(zhuǎn)錄類似于先前描述的耗盡的T細胞，CD8+T細胞浸潤PDA顯示ACADVL表達減少。

（2）人CD8+T細胞浸潤PDA的脂質(zhì)積累和ACADVL功能障礙

與小鼠模型相似，我們發(fā)現(xiàn)LC甘油磷脂積累在七個人類PDA樣本中的五個，這種積累對于PE和PI是最明顯的。在12個人類PDA腫瘤和9個匹配的鄰近正常胰腺組織上的單細胞RNA-seq證實，浸潤這兩個不同胰腺微環(huán)境的CD8T細胞轉(zhuǎn)錄不同，人類PDA浸潤的CD8T細胞降低了與細胞毒性特征相關(guān)的基因的表達。用特異性熒光共軛抗體對22例慢性胰腺炎和96例PDA腫瘤進行多光譜圖像分析，在蛋白質(zhì)水平上證實ACADVL在腫瘤浸潤CD8T細胞中的特異性下調(diào)。

思路總結(jié)

1.質(zhì)譜成像檢測到在胰腺上皮內(nèi)瘤變（PDA）從早期到晚期的腫瘤微環(huán)境（TME）中脂質(zhì)積累；

2.免疫組化和流式分析CD8+T細胞在PDA進展過程中功能受損；

3.相對定量分析及主成分分析胰腺內(nèi)CD8+T細胞積累非常長鏈脂肪酸（VLCFAs），CD8+T細胞功能障礙與特定長鏈脂肪酸（LCFAs）的積累有關(guān)；

4.透射電鏡及流式分析胰內(nèi)CD8+T細胞在富含脂質(zhì)的PDA TME中代謝耗盡；

5.高通量測序及免疫熒光分析浸潤晚期腺上皮內(nèi)瘤變的CD8+T細胞顯示酰-CoA脫氫酶（ACADVL）下調(diào)；

6.用一個含有TCR1045單獨或TCR1045和ACADVL的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)導(dǎo)CD8+T細胞，注射小鼠，檢測T細胞存活率及細胞因子分泌情況，腫瘤特異性T細胞工程表達更高水平的ACADVL表現(xiàn)出增強的代謝適應(yīng)能力；

7.組織脂質(zhì)染色、高通量測序、質(zhì)譜成像、免疫熒光檢測人胰腺內(nèi)TME中CD8+T細胞ACADVL下調(diào)。

我們的服務(wù)

廣州輝園苑醫(yī)藥有限公司為您竭誠服務(wù)，為您的科研課題保駕護航，可提供各類實驗服務(wù)，包括但不僅限于：動物模型實驗及飼養(yǎng)、細胞培養(yǎng)及分離、免疫組織化學(xué)及免疫熒光、紅油O染色及蘇木精-伊紅染色、QPCR及WB、流式檢測及分析、高通量測序、質(zhì)譜成像、生信分析等。