1. 腺相關(guān)病毒（AAV）背景
腺相關(guān)病毒（AAV）是單鏈DNA病毒，基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，全長(zhǎng)約4.7kb。在多種脊椎動(dòng)物物種中被發(fā)現(xiàn)，包括人類(lèi)和非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物（NHPs）。是微小病毒科家族的成員之一，其增殖復(fù)制需要腺病毒（如Ad）或單純孢疹病毒（HSV）的輔助。在缺乏輔助病毒的情況下，AAV可以在許多類(lèi)型的細(xì)胞中長(zhǎng)期潛伏存在。目前的共識(shí)是，AAV不會(huì)引起任何人類(lèi)疾病。
重組腺相關(guān)病毒（rAAV）： 是利用AAV2型基因組與不同血清型衣殼蛋白基因組結(jié)合產(chǎn)生的混合病毒載體。（通常我們所說(shuō)的AAV其實(shí)是rAAV）
如今，重組AAVs（rAAVs）是基因治療體內(nèi)傳遞的領(lǐng)先平臺(tái)，目前有四款A(yù)AV基因藥物上市：Glybera（2012年，脂蛋白酯酶缺乏癥），Luxturna（2017年，遺傳性視網(wǎng)膜疾病），Zolgensma（2019年，脊髓性肌萎縮癥），Upstaza（2022年7月，AADC缺乏癥）
2. AAV開(kāi)發(fā)史
- 1965-1966年相繼報(bào)道AAV的發(fā)現(xiàn)
- 1982-1983年完成AAV2的基因克隆和基因組測(cè)序
- 1984年 AAV開(kāi)始被用于體外基因傳遞，同時(shí)80年代末高質(zhì)量的重組AAV（rAAV）的開(kāi)發(fā)極大得促進(jìn)了rAAV作為基因傳遞載體的使用
- 1993年 rAAV第一次用于動(dòng)物體內(nèi)基因傳遞，1994年工藝優(yōu)化后被報(bào)道用于哺乳動(dòng)物體內(nèi)持續(xù)基因的表達(dá)
- 1995年 AAV載體首次用于人類(lèi)疾病治療（囊性纖維化疾病）
- 2002-2004，更多的AAV血清型（也就是衣殼蛋白類(lèi)型）被報(bào)道，可以感染更多種類(lèi)的細(xì)胞-->增加可感染譜，極大得擴(kuò)展了體內(nèi)基因傳遞的AAV工具箱
- 2008年 AAV基因治療產(chǎn)品在Leber先天性黑蒙的治療試驗(yàn)中得到了令人信服的結(jié)果
- 2012年 第一個(gè)基于AAV的基因治療藥物Glybera獲得了EMA的批準(zhǔn)
- 2017年 Luxturna成為FDA第一個(gè)批準(zhǔn)的AAV基因治療產(chǎn)品
2. AAV感染機(jī)制
AAV感染機(jī)制如圖2A，分為一下幾個(gè)步驟：
- （1）病毒識(shí)別：腺相關(guān)病毒（AAV）的衣殼蛋白被宿主的糖基化細(xì)胞表面受體識(shí)別（不同的 衣殼類(lèi)型決定它能被哪類(lèi)細(xì)胞識(shí)別）
- （2）病毒內(nèi)化：通過(guò)內(nèi)吞作用觸發(fā)病毒的內(nèi)化并形成內(nèi)體，通過(guò)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的骨架網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行運(yùn)輸
- （3）病毒逸出：受細(xì)胞質(zhì)內(nèi)PH環(huán)境的變化，內(nèi)體產(chǎn)生孔洞造成病毒逸出
- （4）病毒進(jìn)入細(xì)胞核：部分病毒進(jìn)入細(xì)胞核，但并不是所有的AAV都能進(jìn)入細(xì)胞核，也會(huì)有部分被蛋白酶體降解成多肽（多肽可以被MHC遞呈供T細(xì)胞識(shí)別，因此高劑量也會(huì)造成免疫毒性）
- （5）病毒脫殼：進(jìn)入細(xì)胞核的病毒釋放出裸漏的遺傳物質(zhì)，目前有兩種rAAV在使用：?jiǎn)捂湹腁AV（ssAAV）和自互補(bǔ)的AAV（scAAV）
單鏈的AAV：單鏈的AAV（ssAAV）被包裝為正鏈基因組或負(fù)鏈基因組，這些單鏈形式在到達(dá)細(xì)胞核時(shí)仍然轉(zhuǎn)錄惰性，必須轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA是轉(zhuǎn)錄的先決條件。這種轉(zhuǎn)化可以通過(guò)宿主細(xì)胞DNA聚合酶的第二鏈合成（如圖2A Second strand synthesis所示）或通過(guò)在細(xì)胞核中可能共存的正負(fù)鏈的鏈退火來(lái)實(shí)現(xiàn)（如圖2A Strand annealing所示）。
自互補(bǔ)的AAV：自互補(bǔ)的AAV（scAAV）為雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，可以省去ssAAV所需要的“雙鏈轉(zhuǎn)化”步驟，因而進(jìn)入細(xì)胞核脫殼后能被立即轉(zhuǎn)錄。
- （6）scAAV成環(huán)：rAAV基因組中存在的病毒倒置末端重復(fù)序列（ITRs）可以驅(qū)動(dòng)分子間或分子內(nèi)重組，形成環(huán)狀的外泌體基因組，以此形式作為染色體外游離體長(zhǎng)期存在。不過(guò)，載體基因組也可以以非常低的頻率整合到宿主基因組中。
3. AAV基因組結(jié)構(gòu)與血清學(xué)亞型
未改造的AAV是單鏈DNA病毒，基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，全長(zhǎng)約4.7kb（作為載體時(shí)，插入目標(biāo)基因長(zhǎng)度控制在2.8kb左右）。整體可以分為以下3個(gè)區(qū)域（如圖2B）：
- （1）ITR區(qū)：AAV基因組DNA的兩端為145個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的 反向末端重復(fù)序列（Inverted terminal repeat, ITR），ITR序列折疊成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，是DNA復(fù)制起始和包裝重組AAV基因組為感染性的病毒顆粒所需的順式作用元件。
- （2）Rep基因區(qū)： Rep基因編碼Rep78、Rep68、Rep52、Rep40四種蛋白質(zhì)，主要作用于 病毒基因組復(fù)制 以及與 宿主基因組的整合。
- （3）Cap基因區(qū)： Cap基因編碼VP1、VP2和VP3三種病毒衣殼蛋白和組裝激活蛋白AAP，主要作用于 病毒基因組的包裝 以及 從宿主細(xì)胞中的分泌。（現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的十多種常見(jiàn)血清以及上百種病毒變種的主要區(qū)別在于衣殼蛋白Cap基因的不同，編碼結(jié)構(gòu)蛋白的不同會(huì)導(dǎo)致不同血清型的AAV對(duì)不同組織和細(xì)胞感染效率不同）
VP1和VP2蛋白共享VP3序列，并在其N(xiāo)端具有其他殘基。
- VP1：其N(xiāo)端有一個(gè)保守的磷脂酶A2序列，該序列與病毒從體內(nèi)逃逸有關(guān)，并對(duì)其感染性至關(guān)重要
- VP2：該蛋白對(duì)于組裝或者感染并非必不可少
- VP3：該蛋白的核心由保守的β-桶基序組成，決定了不同血清型AAV與宿主細(xì)胞作用受體的差異
4. AAV相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)展
rAAV適用于作為缺陷型遺傳病的基因修復(fù)載體，不同的血清型所靶向的組織類(lèi)型也是不同的。
- AAV2：是人類(lèi)發(fā)現(xiàn)最早、研究最早的血清型，但其有一定局限性；
- AAV5：動(dòng)物體內(nèi)大多存在AAV的抗體（曾被感染，卻不致病），但目前在人體中，AAV5血清型抗體存在的概率最小
- AAV9：從人的肝組織中分離得到，顯示出穿越血腦屏障的能力，使得其成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病（CNS）轉(zhuǎn)運(yùn)載體的主要衣殼
從圖3中可以得到目前臨床試驗(yàn)中的rAAV載體藥物仍然以AAV2為主，靶向器官也局限于眼、肝臟、肌肉，臨床試驗(yàn)都處在較早的臨床I期和II期。
流行病學(xué)分析現(xiàn)實(shí)，40%-80%的人群中AAV抗體陽(yáng)性，這表明人類(lèi)來(lái)源的衣殼可能會(huì)因?yàn)轭A(yù)先存在的AAV衣殼免疫而降低轉(zhuǎn)導(dǎo)效果。同時(shí)，AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9是人類(lèi)特有的。非人類(lèi)來(lái)源分離的衣殼才有可能克服先前存在的免疫。迄今為止，從非人類(lèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物（NHP）中分離的衣殼顯示出巨大的應(yīng)用前景。
選擇合適的衣殼作為基因藥物載體至關(guān)重要，目前的 衣殼設(shè)計(jì)篩選方法：
方法 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn) 特點(diǎn) 天然發(fā)現(xiàn) 可靠性強(qiáng) 篩選難度大，有可能存在免疫抗體 類(lèi)似于挖礦 定向進(jìn)化 定向選擇，針對(duì)性強(qiáng) 技術(shù)門(mén)檻高，周期長(zhǎng)，成本高 通過(guò)自然選擇的方法（需要基數(shù)大才更有效） 理性設(shè)計(jì) 成本低 成功率低 賭小概率事件 AI輔助的定向進(jìn)化 高通量，成本低，周期短 技術(shù)門(mén)檻高 高價(jià)培養(yǎng)特種兵
5. AAV制備工藝
根據(jù) 包裝系統(tǒng) 不同，目前應(yīng)用較多的為 三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體系 和 桿狀病毒-SF9系統(tǒng)，以下為兩種方式的對(duì)比表：
| 包裝系統(tǒng) | 優(yōu)勢(shì) | 技術(shù)上的劣勢(shì) | 商業(yè)上的劣勢(shì) |
|---|---|---|---|
| 三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體系 | 無(wú)輔助病毒污染；生產(chǎn)周期短；可放大懸浮系統(tǒng)；無(wú)/低 許可費(fèi)用 | 工藝相對(duì)容易；空殼率高；低產(chǎn)率 | 工藝放大成本高 |
| 桿狀病毒-SF9系統(tǒng) | 可放大懸浮系統(tǒng)；無(wú)血清培養(yǎng) | Baculovirus污染；交貨周期長(zhǎng)；純化分析要求高 | 細(xì)胞系許可費(fèi)用高；投資成本大；臨床生產(chǎn)時(shí)間長(zhǎng) |
5.1 三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體系-HEK293
將以下3種質(zhì)粒導(dǎo)入工程細(xì)胞HEK293，各元件表達(dá)并組裝rAAV（有可能存在空殼病毒，后續(xù)需要純化剔除）
- （1）輔助質(zhì)粒（Adenovirus-derived helper plasmid）：含有腺病毒的重要元件，參與病毒顆粒增殖
- （2）包裝質(zhì)粒（Plasmid containing two essential AAV genes）：包含Cap（編碼病毒衣殼蛋白）和Rep（參與病毒的復(fù)制）基因
- （3）表達(dá)質(zhì)粒（Gene therapy sequence）：即包含需表達(dá)目的基因以及兩個(gè)末端ITR
5.2 桿狀病毒-SF9
利用桿狀病毒表達(dá)載體（Baculovirus expression vectors, BEVs）感染SF9昆蟲(chóng)細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)rAAV病毒顆粒。借助SF9細(xì)胞可以大量表達(dá)重組蛋白的特點(diǎn)，該系統(tǒng)使用含有rAAV基因組以及AAV-Rep、AAV-Cap基因的昆蟲(chóng)桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)SF9細(xì)胞，使rAAV在SF9細(xì)胞中組裝，最終達(dá)到大規(guī)模生產(chǎn)rAAV的目的。
- 將rep/cap基因穩(wěn)定地整合到SF9細(xì)胞系基因組，并受一個(gè)啟動(dòng)子/增強(qiáng)子控制
- 桿狀病毒感染可誘導(dǎo)該啟動(dòng)子/增強(qiáng)子
由于SF9昆蟲(chóng)細(xì)胞可以在大規(guī)模反應(yīng)器中高密度懸浮培養(yǎng)，因此該系統(tǒng)更容易放大規(guī)模；同時(shí)，桿狀病毒對(duì)于哺乳動(dòng)物和植物是非致病性的，且采用無(wú)血清培養(yǎng)體系，相較依賴(lài)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)更為安全。2012年，歐洲藥品管理局（EMA）批準(zhǔn)的首個(gè)rAAV基因治療藥物Glybera正是利用SF9昆蟲(chóng)細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)生產(chǎn)的rAAV病毒顆粒。
6. 參考鏈接
AAV背景介紹：Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery
三質(zhì)粒制備系統(tǒng)：TRIPLING DOWN ON EFFICIENT GENE THERAPY PRODUCTION
