Investigation of an FGFR-Signaling-Related Prognostic Model and Immune Landscape in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中與FGFR信號相關(guān)的預(yù)后模型和免疫景觀研究

發(fā)表期刊：Front Cell Dev Biol

發(fā)表日期：2022 Feb 14

影響因子：6.081

DOI:? 10.3389/fcell.2021.801715

一、研究背景

????????頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率每年超過60萬例，包括一組異質(zhì)性的腫瘤，產(chǎn)生于口腔、口咽、喉、下咽、鼻咽和鼻竇腔。

????????成纖維細(xì)胞生長因子受體（FGFR）是一種受體酪氨酸激酶（RTK）信號通路，參與調(diào)節(jié)腫瘤的血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移。它被認(rèn)為是纖維化發(fā)展的一個促進(jìn)因素，引起肝臟纖維化的加劇，系統(tǒng)性硬化（SS），特發(fā)性肺纖維化（IPF）等。

????????缺氧作為腫瘤的一個標(biāo)志，是一個強有力的微環(huán)境因素，促進(jìn)各種癌癥的增殖和進(jìn)展。以前的研究表明，缺氧的HNSCC細(xì)胞觸發(fā)糖酵解以獲得能量，平衡代謝和生物能量。此外，激活的成纖維細(xì)胞合成了過多的膠原蛋白，導(dǎo)致了缺氧的微環(huán)境，這可能會惡化疾病的進(jìn)展。

二、材料與方法

1、數(shù)據(jù)來源

1） TCGA：483名HNSCC患者

2） GEO：RNA-seq數(shù)據(jù)和相關(guān)的臨床病理數(shù)據(jù)（GSE41613），包括97名HPV陰性口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）患者；一個單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)集（GSE139324）被用于分析HNSCC患者的腫瘤免疫浸潤，包括來自18個HNSCC患者的腫瘤浸潤免疫細(xì)胞和來自5個健康供體扁桃體的組織常駐免疫細(xì)胞

2、分析流程

流程圖

三、實驗結(jié)果

01 - HNSCC中的纖維化信號和與纖維化相關(guān)的DEGs

????????從TCGA數(shù)據(jù)庫下載的發(fā)現(xiàn)隊列中包含483名HNSCC患者的表達(dá)譜和臨床信息。70個與FGFR信號通路正相關(guān)的基因被用來評估患者的纖維化信號激活狀況。基于UMAP算法，作者利用纖維化相關(guān)的表達(dá)矩陣將患者分為兩個群組，能夠?qū)⒚總€患者分配到最近的群組（圖2A）。KM圖表明，兩個簇之間生存期存在顯著差異（圖2B）。分別有309名和176名患者被納入群組1和2。

????????為了獲得纖維化相關(guān)的DEGs，比較了兩個集群之間的表達(dá)譜。共有187個纖維化相關(guān)的DEGs在集群1中過度表達(dá)，其中患者的生存率較低，這些DEGs富集在 "對創(chuàng)傷的反應(yīng)"（圖2C）和 "TGF-beta信號通路"（圖2D）。這意味著群集1中的患者處于較高的纖維化激活狀態(tài)。富集分析顯示，群集2中過量表達(dá)的186個DEGs富集在 "免疫球蛋白復(fù)合物"（圖2E）、"異生物細(xì)胞色素P450的代謝"（圖2F）。這些發(fā)現(xiàn)與以前的研究一致，即免疫狀態(tài)好的患者預(yù)后更好。

圖2 根據(jù)FGFR信號通路對患者進(jìn)行分組

02 - HNSCC的缺氧狀態(tài)、糖酵解狀態(tài)和缺氧-糖酵解相關(guān)的DEGs

????????利用 "GSVA "軟件包，實施ssGSEA算法，量化每個HNSCC患者在MSigDB中的缺氧或糖酵解標(biāo)志基因的富集分?jǐn)?shù)。為了確定缺氧和糖酵解對預(yù)后的影響，進(jìn)一步在患者的缺氧和糖酵解得分中進(jìn)行單變量Cox回歸分析。如圖3A的森林圖所示，低氧和糖酵解被認(rèn)為是HNSCC患者預(yù)后的危險因素。基于最大選擇的秩統(tǒng)計，根據(jù)缺氧（圖3B）和糖酵解（圖3C）得分將患者分為兩組。進(jìn)一步將缺氧和糖酵解狀態(tài)綜合為一個二維指數(shù)，將患者分為三組，即缺氧高/糖酵解高、缺氧低/糖酵解低和"混合 "組。三組之間的存活率有明顯的差異（圖3D）。生存分析（KM）顯示，低氧/高糖組的存活率高于低氧/低糖組（圖3E）。除此之外，混合組處于一個中間水平。在比較低氧/低糖和低氧/低糖之間的表達(dá)譜后，共得到108個低氧-糖酵解相關(guān)的DEGs。

圖3 根據(jù)患者的缺氧和糖酵解狀態(tài)進(jìn)行分組

03 - 在TCGA數(shù)據(jù)集中構(gòu)建纖維化-缺氧-糖酵解相關(guān)的預(yù)后模型

????????將上述從HNSCC中篩選出的334個纖維化相關(guān)和108個缺氧-糖酵解相關(guān)的DEGs取交集，得到39個共有基因（圖4A）。為了進(jìn)一步篩選出預(yù)后性DEGs，對39個DEGs進(jìn)行單變量Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)21個P<0.05的DEGs（圖4B）。其中，大部分是風(fēng)險DEGs。用LASSO回歸方法從上述21個預(yù)后DEGs中選出6個關(guān)鍵變量，其中4個是風(fēng)險DEGs，2個是保護(hù)性的（圖4C,D）。對于每個HNSCC患者，根據(jù)6個特征性DEGs的表達(dá)水平和LASSO Cox回歸的相應(yīng)系數(shù)計算出風(fēng)險分?jǐn)?shù)：風(fēng)險分?jǐn)?shù)=0.0369 × AREG的表達(dá)+ 0.03432 × THBS1的表達(dá)+ 0.02182 × SEMA3C的表達(dá)+ 0.07125 × ANO1的表達(dá)+（-0.07718）× IGHG2的表達(dá)+（-0.09177）× EPHX3的表達(dá)。使用最大選擇等級法作為劃分依據(jù)，根據(jù)風(fēng)險評分將患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組（圖4E）。與高危組相比，低危組對預(yù)后的影響明顯更好（圖4F）。

圖4 構(gòu)建HNSCC患者的預(yù)后生存模型

????????作者對483名HNSCC患者進(jìn)行了生存分析，根據(jù)原發(fā)腫瘤的位置進(jìn)行重組，試圖驗證預(yù)后模型的可靠性。在幾個HNSCC高發(fā)區(qū)，如舌頭和喉部（圖5B,D），生存期比較顯示，高危組與患者的預(yù)后較差有關(guān)。扁桃體、下咽等也是如此（圖5A,C）。單變量Cox回歸分析表明，風(fēng)險評分與其他臨床特征（如年齡）相似，可被視為評估HNSCC患者預(yù)后的一個獨立風(fēng)險因素（圖5E）。此外，ssGSEA被用來估計患者的免疫細(xì)胞浸潤情況。為了探索預(yù)后模型和免疫細(xì)胞浸潤之間的相關(guān)性，對六個最佳預(yù)后特征和免疫細(xì)胞浸潤評分進(jìn)行了相關(guān)分析（圖5F）。此外，與低風(fēng)險組相比，在高風(fēng)險組中觀察到八種特定的免疫細(xì)胞浸潤明顯減少，即活化的B細(xì)胞、未成熟的B細(xì)胞、活化的CD4 T細(xì)胞、活化的CD8 T細(xì)胞、效應(yīng)記憶CD8 T細(xì)胞、MDSCs和肥大細(xì)胞（圖5G）。

圖5

????????基于纖維化-缺氧-糖酵解的預(yù)后模型在一個獨立隊列 "GSE41613 "中得到進(jìn)一步驗證。在97名OSCC患者的表達(dá)矩陣中搜索預(yù)后模型中的6個基因，發(fā)現(xiàn)了其中的5個基因。單變量Cox回歸分析證實，AREG、THBS1、SEMA3C和ANO1是患者預(yù)后的危險因素。相反，EPHX3是一個保護(hù)性的，這與之前進(jìn)行的模型一致（圖6A）。根據(jù)最大選擇等級統(tǒng)計，根據(jù)每個基因的表達(dá)水平將患者分為兩組（圖6B,D,F,H,J），并進(jìn)行生存分析（圖6C,E,G,I,K）。KM曲線顯示，預(yù)后模型中四個風(fēng)險基因表達(dá)水平較高的患者OS較差（圖6C,E,G,I），而保護(hù)基因則相反（圖6K）。

圖6 在外部數(shù)據(jù)集中進(jìn)行驗證（GSE416130）

04 - 預(yù)后標(biāo)志物的IHC分析

????????為了進(jìn)一步驗證預(yù)后相關(guān)分子在HNSCC標(biāo)本和頭頸部正常鱗狀上皮的表達(dá)，作者對HNSCC的石蠟切片進(jìn)行了IHC染色分析。IHC染色分析表明，通過抗體ab135842（圖7A-F）和ab134050（圖8A-F）的量化，SEMA3C和IGHG2在HNSCC組織中的表達(dá)略高。

????????根據(jù)HPA的蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)，比較了HNSCC組織和正常位于頭頸部的鱗狀上皮（如口腔鱗狀上皮）中六個基因簽名的蛋白表達(dá)。初步推斷，這些基因的蛋白表達(dá)在HNSCC和正常組織之間存在差異。

圖7 SEMA3C在HNSCC和正常組織中的蛋白表達(dá)的IHC分析

圖8 HNSCC和正常組織中IGHG2的蛋白表達(dá)的IHC分析

05 - 基于scRNA-Seq的HNSCC患者的纖維化相關(guān)的免疫景觀

????????為了進(jìn)一步了解纖維化信號和免疫之間的相關(guān)性，作者分析了從GEO數(shù)據(jù)集 "GSE139324 "下載的scRNA-seq數(shù)據(jù)。共有23個樣本被用于分析。其中，18個樣本是來自HNSCC患者（HPV陰性）的腫瘤浸潤免疫細(xì)胞，5個是來自健康供體扁桃體的組織駐留免疫細(xì)胞。在用和諧算法整合數(shù)據(jù)和用t-SNE算法進(jìn)行分檔后，20個細(xì)胞集群被成功分類。此外，HNSCC患者和健康供體（HD）之間每個細(xì)胞亞群的數(shù)量都有明顯的差異（圖9A）。通過幾個細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物的表達(dá)，集群4和11被定義為單核細(xì)胞。群組3、9、13、14和20表達(dá)了與B細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記（如CD79A），其余的群組表達(dá)了與T細(xì)胞相關(guān)的基因（如CD3D）（圖9B）。在圖9C,D中，低存活率患者中高表達(dá)FGF-受體信號相關(guān)基因的細(xì)胞和高表達(dá)的DEGs被嚴(yán)重強調(diào)，其中大部分在集群4和11中高表達(dá)。與健康對照組相比，患者中的單核細(xì)胞組成明顯較高（圖9E）。在HNSCC和HD之間，第4和第11群的細(xì)胞數(shù)量有明顯的差異（圖9F,G）。點陣圖的熱圖意味著所提到的基因在單核細(xì)胞中比在其他種類的免疫細(xì)胞中更富集（圖9H）。

圖9

四、結(jié)論

????????FGFR信號、缺氧和糖酵解的狀態(tài)與HNSCC患者的預(yù)后相關(guān)。上述的預(yù)后模型可能為預(yù)后預(yù)測和個體化治療提供潛在的應(yīng)用價值。