該綜述中包括了 279 項研究衰老對生理小鼠模型中生殖器官、組織和細胞的生殖過程的影響。本文按生殖終點組織了文獻綜述，從內分泌和卵巢功能到卵母細胞和卵子動力學、受精和胚胎發育以及妊娠和分娩結局。在這里，我們總結了生殖系統、器官、組織和細胞的正常生理學，為審查生殖衰老的表型特征、在整個生殖系統和其他器官中保守的衰老標志以及生殖衰老獨有的機制提供了見解。
女性生殖軸是最早衰老的器官系統之一，這對生育能力和整體健康產生了影響。在這里，我們基于廣泛使用的生理衰老小鼠模型，提供了一個全面的女性生殖衰老生物學過程的綜述，涵蓋了生殖器官、組織和細胞，并描述了支撐這些表型的機制。總體而言，衰老與下丘腦-垂體-卵巢軸的功能失調、卵巢基質的擾動、卵子數量和質量的下降以及子宮形態和功能的改變相關，這些都導致了受精能力的下降和胚胎發育受損。最終，這些與年齡相關的表型會影響懷孕結果，并對后代產生不良后果。衰老的保守機制，以及那些特有的生殖系統機制，支撐了這些表型。了解這些機制將有助于開發延長女性生殖壽命、支持內分泌功能和整體健康的治療方法。
女性生殖系統是最早衰老的人類器官系統之一；女性的生育能力在三十多歲時開始下降，且在更年期時生殖功能完全停止。此外，女性生殖衰老對整體健康有影響，因為內分泌功能的喪失增加了患心血管疾病、骨質疏松癥、免疫衰老和神經退行性疾病的風險。女性生殖衰老對社會也有影響，表現為推遲生育和經歷與年齡相關的不孕癥。盡管全球平均預期壽命在增加，但更年期的平均年齡保持相對穩定；因此，經歷更年期的人們在改變的內分泌環境中生活得更長。理解女性生殖衰老的機制對于改善生殖結果并支持全球一半人口的健康壽命至關重要。
非哺乳動物模型，包括果蠅、秀麗隱桿線蟲和非洲爪蟾，在揭示與年齡相關的配子質量下降、生殖功能衰退和胚胎發生受損的分子機制方面發揮了重要作用。然而，由于這些模型與人類缺乏生理相似性，因此通過它們得出的結論并不總是具有臨床相關性。盡管也使用人類和非人類靈長類動物樣本來研究生殖衰老，但它們難以獲取和進行實驗操作，而且具有異質性。相比之下，嚙齒動物模型壽命較短，操作簡便，且展現出與人類相似的生理特征，因此非常適合用于轉化研究。
常用的鼠類模型用于研究生殖衰老，包括生理衰老模型，其中小鼠經歷自然衰老過程；手術模型，其中切除卵巢組織；以及一些治療方法，如4-乙烯基環己烯二環氧化物（用于耗竭卵巢小體）、有害生殖細胞的化療藥物和輻射治療。還有一些遺傳小鼠模型，通過突變改變卵泡發育或激素生產。盡管常見的實驗室小鼠品系并未完全重現人類生殖衰老的所有方面（主要是缺乏月經，從而也缺乏更年期），但它們確實表現出了生殖過渡和隨年齡遞減的生殖功能。
盡管月經喪失是人類生殖衰老的一個重要臨床標志，但僅通過更年期來定義生殖生命周期的結束是有限的。因此，有必要改變哺乳動物年齡相關生殖衰退的定義，將其稱為“卵巢衰退”（oopause），即排卵的永久性停止。通過這種方式進行比較時，小鼠在卵巢衰退后度過的時間與人類相似，這支持了小鼠作為生殖衰老研究重要模型的有效性。對哺乳動物模型（包括嚙齒動物和非人類靈長類動物）的比較揭示了生殖衰老的保守表型和機制。
本綜述聚焦于生理性衰老小鼠模型，旨在定義在生殖功能逐漸衰退過程中發生的關鍵生物學過程和機制，特別是指在生殖功能停止之前的這一時期，該時期模擬了人類的圍絕經期。文獻搜索所使用的標準以及關于小鼠在生殖上定義為年輕或年老的年齡、品系、產仔情況和體重等關鍵信息，在補充信息、補充表格1–6和補充圖1–3中進行了總結。生殖生理學終點的年齡依賴性變化從內分泌和卵巢功能到卵母細胞和卵子動態、受精與胚胎發育、以及妊娠和分娩結果進行闡述。相關的正常生理過程在補充圖4中進行了描述，以提供年齡相關變化的背景。本文總結了生殖衰老的特征（圖1a），強調了在生殖組織和體細胞組織中保守的衰老標志物，并識別了獨特的生殖衰老機制（圖1b和圖2）。這些知識為提出假設、研究機制以及進一步探索人類生殖衰老提供了機會，也為治療和干預的開發提供了方向。
內分泌功能
激素動態變化
隨著年齡的增長，小鼠會經歷下丘腦-垂體-卵巢（HPO）軸的功能紊亂（圖1a和補充圖4a）。生育衰老的小鼠具有較高的促卵泡激素（FSH）水平，這在一定程度上是由于卵巢的類固醇反饋控制喪失，卵巢經歷了與年齡相關的卵泡喪失。隨著卵泡數量的減少，抑制素水平也會下降，FSH的負反饋作用喪失。血漿FSH水平在中年時開始上升，而此時卵巢儲備——卵巢中的未成熟原始卵泡數量——仍然充足，表明年齡相關的FSH升高并非僅僅由于卵泡喪失。實際上，隨著年齡的增長，下丘腦和垂體也失去了對卵巢分泌雌激素的反應能力；這種對雌激素反應性的喪失也促進了FSH水平的上升。隨著年齡的增加，基礎的黃體生成素（LH）水平以及LH高峰期的血漿LH濃度都會受到抑制，催乳素水平也是如此。
盡管小鼠進入無發情期的過渡過程具有異質性，但衰老小鼠的血清雌二醇和孕酮水平通常與去卵巢小鼠相匹配。衰老小鼠的血清睪酮水平在現有文獻中沒有描述。傳統的類固醇激素測量方法包括免疫分析法，但由于抗體表位與非特異性背景之間的交叉反應，這些方法缺乏特異性，并且會導致激素水平的夸大。液相色譜?質譜（LC–MS）技術的進步使得能夠在低容量樣本中準確測量類固醇激素和生物合成中間體，但這一技術尚未應用于整個生殖衰老過程的研究。
類固醇激素，如雌二醇、孕酮和睪酮，是由膽固醇合成的。催化類固醇激素合成的3β-羥類固醇脫氫酶的濃度和活性在衰老卵巢中減少。然而，卵巢中的總膽固醇含量隨著年齡的增長而增加，外源性促性腺激素刺激能夠恢復3β-羥類固醇脫氫酶的活性，這反映了在這些小鼠中膽固醇轉化為性激素的過程存在與年齡相關的缺陷。
抗穆勒管激素（AMH）是由生長卵泡中的顆粒細胞產生的蛋白質激素，隨著年齡的增長，它的水平下降，這主要是由于卵巢儲備的耗竭，而不是表達下調。總體而言，由于衰老小鼠中細胞間通訊的改變，HPO軸的反饋調節和類固醇生成受到顯著影響，導致內分泌狀態不理想，從而改變了發情周期（圖2）。
下丘腦-垂體卵巢軸? 在小鼠和人類中，下丘腦-垂體-卵巢 （HPO） 軸在動態反饋回路中協調激素的產生和釋放，以調節生殖功能。促性腺激素釋放激素 （GnRH） 由下丘腦以搏動方式釋放，驅動垂體分泌促性腺激素、卵泡刺激素 （FSH） 和黃體生成素 （LH）。FSH 誘導卵巢卵泡及其封閉的卵母細胞生長以及顆粒細胞產生雌二醇。生長卵泡中的雌二醇在正反饋回路中驅動垂體進一步產生 FSH。顆粒細胞也產生蛋白質激素抑制素，抑制垂體產生卵泡刺激素。隨著抑制素水平的持續上升和雌激素的峰值，卵泡刺激素水平開始下降，垂體產生大量的黃體生成素，導致人類的單個卵子或小鼠的多個卵子排卵。排卵后，殘留的卵泡經歷黃體化形成黃體，黃體產生黃體酮，黃體酮作用于子宮，使子宮內膜增厚，為受精卵的著床做準備。如果植入沒有發生，人體內的子宮內膜上皮脫落或小鼠體內的子宮內膜被重新吸收，循環往復。這個周期在人類中持續28天，在小鼠中縮短到4-5天，這使它們成為生殖研究特別有用的模型（補充圖4a）。
小鼠的發情周期分為四個階段：發情前期（ proestrus ）、發情期（ estrus ）、發情后期（ metestrus ）和退情期（ diestrus ）。發情前期通常與人類月經周期的卵泡中期相對應，此時卵泡刺激素上升促進卵泡生長和雌二醇合成。在發情前期結束時，抑制素增加，黃體生成素激增誘導排卵，導致雌二醇減少。發情期和發情后期平行于排卵后的黃體期，此時黃體酮水平較高，而退情期對應于黃體晚期/卵泡早期，此時黃體酮下降，雌激素開始上升。小鼠的動情周期可以通過陰道細胞學來追蹤，比較三種細胞類型的相對豐度：白細胞、有核上皮細胞和角化上皮細胞。
發情周期
盡管隨著年齡的增長，發情周期的規律性會受到影響，但特定的變化依賴于品系。總體而言，隨著年齡的增加，正常發情周期的次數減少，周期長度增加，這通常是由于持續的黃體后期和排卵后期，或是延長的發情前期導致未能進入發情期。發情前期的高峰期雌二醇（E2）延遲以及整個周期中孕酮（P4）水平降低，會導致E2:P4比值失衡，從而延遲發情并加劇下丘腦-垂體-卵巢（HPO）軸功能障礙。隨著年齡的增長，一些品系會在周期停止后出現持續的陰道角質化（PVC），并進入持續的黃體后期狀態。對于年輕的發情周期正常的小鼠，陰道上皮細胞的增殖和分化是由雌激素驅動的。發情期的上皮細胞角質化是由于發情前期雌二醇升高引起的，并且是小鼠對交配有接受能力的階段。在生殖年齡已過的老年小鼠中，PVC發生在沒有發情周期的情況下，表明陰道上皮細胞的分化獨立于雌激素的刺激。PVC持續的長度與周期停止的年齡成反比；早期停止發情周期的小鼠，PVC會持續更長時間，反之亦然。正常的發情周期性可以獨立于生育狀態持續；一些研究發現，小鼠在停止繁殖后仍能保持正常的發情周期。這些研究還發現，表現出較長正常發情周期的小鼠往往具有更長的壽命，表明完整的HPO軸對壽命的重要性。
卵巢及卵巢微環境
卵巢或女性性腺有兩個主要功能：1） 支持女性配子的發育，以及 2） 產生和釋放激素以響應刺激。卵巢卵泡是卵巢的功能單位，每個卵泡由一個卵母細胞組成，卵母細胞周圍環繞著支撐顆粒和卵泡膜細胞。原始卵泡池是在胎兒發育過程中建立的，在女性的一生中沒有得到補充；小鼠也是如此。在每個周期中（無論是人類的月經周期還是小鼠的發情周期），一群被激活的卵泡經歷卵子發生和卵泡發生，最終產生一個（人類）或多個（小鼠）成熟的卵子，這些卵子可以排卵和受精。卵泡周圍是卵巢間質，由免疫細胞、血液和淋巴管、神經、細胞外基質（ECM）和其他支持卵巢功能的成分組成（補充圖4b）。卵泡發生和黃體生成的過程對于類固醇性激素的合成也是必不可少的，類固醇性激素驅動卵母細胞發育和排卵，并確保受精卵的成功著床。
卵泡動力學
卵巢卵泡是卵巢的功能單位，每個卵泡由一個卵母細胞和圍繞它的顆粒細胞及卵巢膜細胞組成（補充圖4b）。原始卵泡池或卵巢儲備是在胎兒發育過程中建立的，并且無法再生；因此，它是女性生育壽命的一個標志（圖1）。出生時卵泡的總數和卵泡消耗的速度與品系相關依賴。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）–PTEN–Akt信號通路調控原始卵泡的激活和生長，該通路中蛋白質的磷酸化水平增加，包括哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和蛋白激酶B（Akt），與原始卵泡的激活相關。防止卵泡激活和卵泡萎縮有助于保存卵巢儲備。最近，有研究提出，原始卵泡的隨機激活和出生時原始卵泡的過剩供應是一個嚴格調控的過程，旨在確保卵泡的持續供應并維護卵巢功能。
mTOR復合物在響應激素、生長因子、細胞因子、氧氣水平和包括氨基酸在內的營養物質時調節生長和代謝，是衰老過程中的關鍵角色。使用小分子抑制劑雷帕霉素（或其類似物）抑制mTOR復合物可延長整體壽命并延緩與年齡相關的疾病，目前對于這種藥物在年齡相關不育方面的潛力也存在關注。短期使用雷帕霉素抑制mTORC1的老鼠表現出卵巢儲備的保持和卵母細胞質量的改善。然而，鑒于在治療過程中觀察到暫時性不育和發情周期的停止，仍需要更多的安全性和有效性研究。通過熱量限制，營養攝入與生殖衰老之間的關系也得到了探討，熱量限制導致暫時的不育，隨后延長了生殖壽命。這些發現表明，飲食的影響可能比單純的熱量攝入更為復雜，并且可能依賴于蛋白質和支鏈氨基酸的組成。此外，卵泡池的消耗與Hippo信號通路的衰老相關變化有關，Hippo信號通路是一個進化上保守的途徑，在調節細胞增殖和細胞命運方面發揮著核心作用，這些過程也涉及到原始卵泡的激活。
除了卵巢儲備較低外，生殖老化的小鼠與年輕小鼠相比，生長中的卵泡數也更少。這些卵泡在生長過程中表現出年齡依賴性的紊亂，來自老鼠的二級卵泡中的卵母細胞較大，而這些二級卵泡與年輕小鼠中的相似卵泡相比卵母細胞較小。此外，生長中的卵泡隨著年齡的增長表達更高水平的炎癥基因，這最終可能影響卵子質量。
衰老的卵巢及其卵泡表現出線粒體功能障礙（見圖2）。線粒體是母系遺傳的細胞器，負責細胞呼吸和能量生產。在生殖老化小鼠的卵泡發生過程中，卵母細胞中的線粒體定位、數量和大小發生了紊亂。與年輕小鼠相比，衰老小鼠在初級卵泡階段的卵母細胞相對于卵母細胞胞質區的線粒體數量減少，但在其他卵泡階段則沒有這種變化。在線粒體的形態學上，線粒體由內膜折疊成嵴，內膜包含呼吸復合物I–IV，構成電子傳遞鏈（ETC），并被外膜包圍。當電子通過每個復合物傳遞時，會形成化學梯度，推動ATP的生成。來自電子傳遞鏈的電子泄漏可以產生活性氧（ROS），它們積聚并導致細胞和組織損傷。隨著年齡的增長，卵巢中的ROS水平增加，導致卵泡細胞和卵巢表面上皮（OSE）中的脂質、蛋白質和DNA的氧化損傷。此外，卵巢中抗氧化劑的水平以及對抗ROS和ROS引起的損傷的蛋白質表達也隨著年齡的增長而減少，增加了對氧化損傷的易感性。
參與ATP生產的電子載體包括還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、黃素腺嘌呤二核苷酸（FADH2）和輔酶Q10（CoQ10）。CoQ10是一種具有抗氧化特性的必需酶，能夠將與NADH或FADH2偶聯的電子沿電子傳遞鏈（ETC）轉運。此外，CoQ10還參與呼吸復合物的組裝和穩定性，這對最小化ROS的生成至關重要。CoQ10的生物合成涉及由四聚體十碳二烯基二磷酸合成酶轉化甲羥戊酸，并通過CoQ基因編碼的多種酶的活性完成。隨著年齡的增長，卵巢中負責CoQ10合成的酶（如PDSS2和COQ6）的表達減少。年輕雌性卵母細胞中的CoQ10缺乏與線粒體活性低下和染色體錯位相關。CoQ10補充可以改善與年齡相關的線粒體功能障礙。甲羥戊酸途徑是一種代謝途徑，負責合成甾醇和異戊二烯類化合物，對卵母細胞成熟至關重要。隨著年齡增長，該途徑在顆粒細胞中的表達下調，導致減數分裂缺陷。此外，維持細胞中NAD+和NADH的可用性對氧化還原過程非常重要，而其減少可能導致線粒體代謝受損并增加氧化應激。
排卵、卵巢上皮和卵巢囊腫
在LH激增的反應下，卵子從竇卵泡釋放到輸卵管中，而卵泡的殘余細胞則經歷黃體化，形成黃體（CLs），并產生孕酮（見補充圖4b）。與年輕小鼠相比，繁殖老化的小鼠每個周期排出的卵子較少，且黃體數量較少。除此之外，老年小鼠的排卵失敗發生率較高，表現為卵巢中含有被困在未破裂黃體化卵泡中的卵母細胞，以及含有完全擴展的卵丘–卵母細胞復合體（COCs）的無排卵卵泡。排卵受損可能部分由于與年齡相關的纖維化；對老年小鼠使用抗纖維化藥物可以增加排卵的卵子數量。年輕小鼠和老年小鼠的黃體在結構上也有所不同。與年輕小鼠的黃體相比，老年小鼠的黃體具有更大的橫截面積和增加的細胞質肥大。來自繁殖老化小鼠的黃體血管化較差，周圍有更多的膠原質，并且包含類淀粉樣沉積物。
LH激增通過產生廣泛的細胞外基質（ECM）觸發卵丘細胞層的擴展（見補充圖4b）。卵丘擴展對于最佳排卵和成功受精至關重要。隨著生殖年齡的增長，卵丘擴展和COC的ECM完整性受到損害，部分原因是透明質酸（HA）水平的降低（見圖1）。在封閉的定時影像系統下監測時，COC表現出特征性的擴展動力學模式，而衰老與這些形態動力學參數的特定品種變化相關。COC擴展受損可能是衰老過程中觀察到的排卵缺陷的原因之一。
在卵泡破裂部位，卵巢上皮（OSE）被破壞，排卵后會修復（見補充圖4b）。年輕小鼠的OSE由單層扁平細胞組成，但隨著年齡增長，OSE表現出顯著的增生。老年小鼠的OSE常常出現向卵巢基質內的內陷、脫落（即OSE從下方的卵巢組織中脫離）和異常的乳頭狀增生。這些與年齡相關的形態學差異可能是由于mTOR信號過度活躍所致，因為在生殖年齡較大的小鼠中，基因和藥理學抑制mTOR信號通路能夠有效減少OSE增生和乳頭狀增生。排卵誘導后，來自老年小鼠卵巢的OSE相較于年輕對照組，表現出細胞增殖和凋亡減少以及傷口愈合反應受損。
卵巢囊腫的來源不明確，且隨著生殖年齡的增加而增多。卵巢上皮（OSE）與年齡相關的內陷可能導致卵巢內包涵囊腫，這些囊腫可以表現為良性的漿液性囊腺瘤，或引發上皮性卵巢癌。然而，大多數與年齡相關的卵巢囊腫與卵巢門相連，提示它們可能源自網狀卵巢（rete ovarii），這是中腎管的殘余結構。網狀卵巢在生殖年齡較大的小鼠中出現擴張，通常在卵巢內形成囊性空間。隨著年齡的增長，網狀卵巢管道可能表現為增生性和/或肥大的上皮，同時伴有乳頭狀突起，但研究對于這些是否為卵巢上皮腫瘤的來源存在相互矛盾的結果。卵巢囊腫的存在具有高度的品系依賴性。例如，常用于模擬自身免疫疾病的MRL/MpJ品系常常出現卵巢囊腫，而C57BL/6小鼠則沒有。未來的研究需要進一步明確卵巢囊腫是否與一生中的總排卵次數有關，因為相關研究結果存在矛盾。
卵巢微環境
卵泡被基質所包圍，基質由成纖維細胞、免疫細胞、血管和淋巴管、神經、細胞外基質（ECM）及其他成分組成（補充圖4b）。隨著年齡的增長，卵巢微環境因Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的積累而變得纖維化。卵巢纖維化導致組織硬度增加（圖1）。從生育期老鼠的卵巢中去除膠原蛋白后，卵巢的生物力學特性恢復到與年輕對照鼠相似的水平，并延長了生育壽命的相關參數。此外，透明質酸（HA）是一種促進組織水合作用和柔韌性的糖胺聚糖，隨著年齡增長，卵巢中的HA減少。HA的年齡相關下降可能會導致卵巢硬度增加，因為缺乏Has3（一種主要的卵巢基質透明質酸合成酶，隨著年齡增長其表達減少）的老鼠卵巢比同齡對照老鼠卵巢更為僵硬。卵巢基質的年齡相關硬化可能會影響卵泡發生和質量。除了膠原蛋白和透明質酸外，對來自生育期年輕和年老小鼠的原生和ECM富集卵巢的蛋白質組學分析還表明，隨著年齡的增長，核心基質蛋白和與基質相關的蛋白質出現了更廣泛的失調，其中一些在其他器官的纖維化中發揮了作用。
纖維化通常在炎癥之后發生，而卵巢基質隨著年齡的增長變得炎癥性。隨著年齡的增加，卵巢會表達更高水平的促炎和促纖維化細胞因子，如白介素-6，以及參與免疫細胞招募的基因。此外，單細胞RNA測序揭示了與年齡相關的免疫細胞群體的變化，幾種參與適應性免疫的淋巴細胞數量增加。來自老鼠的卵巢還包含一種獨特的多核巨噬細胞群體，這些巨噬細胞與慢性炎癥和非血紅素鐵積累相關。游離鐵是一種過渡金屬，通過費頓反應和哈伯-魏斯反應在紅氧還原過程中催化羥基自由基的形成，從而促進活性氧（ROS）的生成。將外源性鐵過載給予年輕小鼠會導致巨噬細胞增大，這表明與年齡相關的鐵積累可能會引起巨噬細胞的形態學變化。非血紅素亞鐵的積累也表明紅氧還原活性鐵水平的增加，這可以促進氧化應激。
煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是一個至關重要的代謝輔酶和底物，參與多個生理功能，包括細胞redox、線粒體穩態、免疫細胞功能以及基因組和表觀遺傳穩定性，且NAD代謝隨著年齡的增長發生變化。卵巢中的NAD+水平在中年開始下降，早于其他組織，這是由于NAD水解酶CD38的消耗增加。隨著年齡的增長，卵母細胞中的NAD+也會減少。基因刪除CD38或補充NAD+能夠改善與年齡相關的卵巢功能障礙，維持卵巢儲備，減少卵巢炎癥，改變免疫特征，并通過提高卵母細胞的線粒體功能來改善卵母細胞的結果。
細胞衰老是衰老組織的一個標志，指的是細胞周期停滯的狀態，通常是對多種刺激的反應。衰老細胞在增殖停滯后仍然存在，并產生與衰老相關的分泌表型（SASP），這些表型可能具有致病效應。盡管目前沒有統一的標志物來定義衰老細胞，但一些標志物在衰老細胞中常常被觀察到。與衰老相關的β-半乳糖苷酶和周期蛋白依賴激酶抑制因子2A（CDKN2A）陽性細胞已在老鼠的卵巢基質中被發現，無論其生育狀態如何。然而，與老年雌鼠相比，退休繁殖雌鼠的卵巢中CDKN2A陽性細胞更為豐富。此外，與年輕雌鼠相比，老鼠的卵巢中具有較高比例的Cd74陽性和Cxcl10陽性SASP成纖維細胞。進一步的研究有必要確定卵巢中衰老細胞的身份，并描述其特定的衰老表型。
卵母細胞和卵子的動態變化
出生時，原始卵泡內的卵母細胞在減數分裂 I 的前期停滯，其特征是完整的生發囊泡 （ germinal vesicle,? GV） 或細胞核。在卵泡發生過程中，卵母細胞大小增加，但在前期 I 中仍然停滯。在卵泡發生結束時，為了響應 LH 激增，卵母細胞經歷核成熟，為受精做準備。卵母細胞的核成熟涉及減數分裂 I 的恢復和減數分裂進展以形成整倍體配子。減數分裂 I 的完成導致同源染色體通過不對稱細胞分裂分離。這種不對稱的胞質分裂使配子能夠保留其大部分細胞質和細胞大分子，同時將多余的染色體組擠出到極體中。卵母細胞立即進入減數分裂 II 中期 （MII），中間沒有一輪 DNA 復制。能夠受精的成熟配子，現在稱為卵子，在 MII 保持停滯，直到受精開始完成減數分裂 II。卵母細胞的細胞質成熟發生在卵泡形成和卵母細胞成熟的最后階段，以允許 mRNA、蛋白質和其他大分子的積累，這將支持減數分裂、受精和合子基因組激活之前的早期胚胎發育（補充圖 4c）。
核成熟
卵母細胞的核成熟在年齡增長時會受到干擾，這一過程涉及減數分裂 I 的恢復和減數分裂的進行，以形成正常染色體數的配子（補充圖 4c）。在前期階段，染色體會經歷同源重組，同源染色體通過交叉聯接形成聯會，從而防止不分離現象的發生。隨著生育年齡的增加，交叉聯接的頻率降低，且帶有單體染色體（univalents）的卵母細胞頻率增加92-94（圖 1）。
卵母細胞是否能夠經歷減數分裂成熟，似乎取決于卵原核（GV）的定位；具有外圍GV的卵母細胞極有可能不會進行極體排出（PBE）。衰老與GV居中的效率降低相關，從而導致PBE率的下降。卵母細胞有兩種正常的染色質配置：非包圍核仁的去凝縮型真染色質，與轉錄活性相關；或包圍核仁的凝縮型異染色質，與轉錄靜止相關。來自生育年齡較大的小鼠的卵母細胞通常具有較小的GV，且染色質配置高度凝縮，通常在核仁內分布不規則，或呈團塊狀。
關于減數分裂進程的效率和動力學是否隨年齡變化，尚存在爭議。一些研究報告稱，隨著年齡的增長，更多比例的卵母細胞能夠進入第二次減數分裂（MII），而另一些研究則報告了相反的結果。此外，一些研究表明減數分裂I的動力學隨年齡增加而加快，而另一些研究則記錄了減緩的進程或沒有變化。這些差異可能與品系有關。
染色體倍性狀態以及紡錘體和染色體的改變
非整倍體是導致不孕的主要遺傳原因，可能導致自然流產或染色體疾病，包括人類的唐氏綜合征。在卵細胞中，非整倍體主要是由于同源染色體在減數分裂 I 期間的不分離以及在減數分裂 II 期間姐妹染色單體的過早分離。年齡的增長與減數分裂 I 中的缺陷相關，包括染色體在中期 I 紡錘體上的錯位、在后期 I 中滯后染色體的頻率增加，以及隨之而來的分離錯誤的增加。與年齡相關的 MI 錯誤分離可能是由于動粒-微管（K-MT）連接的改變，因為隨著年齡的增長，卵母細胞中較少的動粒對在紡錘體極點上進行端對端連接。動粒-微管連接不當可能是由于紡錘體微管動力學的改變，導致暫時性多極紡錘體的形成，并且在修正K-MT 連接錯誤的過程中失去相關蛋白。此外，來自老鼠的卵母細胞具有受損的動粒組裝和較薄的微管束，更容易形成異常連接。
紡錘體組裝檢查點（SAC）在老年小鼠的卵母細胞中仍然有效，它可以防止在所有動粒-微管（K-MT）連接穩定之前進入后期分裂，這表明其他機制可能導致與年齡相關的錯位分離。Sirtuin 2（SIRT2），一種NAD+依賴性組蛋白去乙酰化酶家族成員，在調節SAC功能中起著重要作用，通過形態寡聚物去除SIRT2會破壞紡錘體組織、染色體排列和K-MT連接。值得注意的是，老年小鼠的卵母細胞中SIRT2蛋白表達減少，這可能促使非整倍體的發生。然而，進一步的研究需要澄清SIRT2的獨特功能以及其他Sirtuin家族成員的潛在補償作用，因為來自全身Sirt2基因敲除小鼠的卵母細胞表現出正常的紡錘體形態。高分辨率顯微鏡觀察揭示了與年齡相關的染色體形態、形狀和空間排列的差異。來自生殖老化小鼠的卵母細胞顯示染色體之間的粘附性增加，表明同源和非同源染色體之間有更多的相互作用，這增加了異常分離的可能性。老年小鼠的減數分裂染色體也比年輕小鼠的更為僵硬。
PSSC最終導致非整倍體，主要是由于與年齡相關的染色體凝聚力下降（見圖2）。染色體臂上的凝聚力保持同源染色體在第一次減數分裂后期之前的連結，而著絲粒凝聚力則將姐妹染色單體連接在一起，直到第二次減數分裂后期。凝聚蛋白介導染色體的凝聚，在胚胎發育中的減數前S期，凝聚蛋白被加載到卵母細胞中的染色體上。凝聚蛋白的時序性去除對忠實的染色體分離至關重要。在卵母細胞中，染色體相關的凝聚蛋白在沒有周轉的情況下保持，直到排卵時在減數分裂成熟過程中被調控性去除。凝聚復合物的一個核心組成部分是kleisin亞基REC8。去除REC8會導致同源染色體解離和姐妹染色單體分離，而在卵母細胞生長期通過異位表達Rec8無法恢復這一過程。凝聚蛋白加載到染色體上的時間與減數分裂之間的延長，導致凝聚蛋白的耗竭，這表現為隨著年齡增加，卵母細胞中動粒間距離的增大。與年齡相關的凝聚力喪失還會觸發著絲粒染色質的去壓縮，導致動粒斷裂和在第一次減數分裂（MI）及第二次減數分裂（MII）中出現不正確的K-MT連接，這進一步促進了非整倍體的發生。此外，隨著卵母細胞年齡的增加，細胞內pH升高，這可能改變凝聚蛋白環的結構。
與PSSC增加一致，來自老鼠的配子在第二次減數分裂后期表現出增加的滯后染色體發生率，這與有絲分裂檢查點（SAC）功能障礙相結合，可能有助于非整倍體的發生。凝聚復合物在第一次減數分裂開始時通過分離酶沿染色體臂被切割，然而，來自老鼠的卵母細胞對分離酶的過早激活更為敏感，這可能導致染色體分離錯誤。然而，著絲粒凝聚力受到shugoshin 2（SGO2）的保護，SGO2通過防止凝聚蛋白亞基REC8的磷酸化，使其對分離酶切割具有抗性。SGO2還通過與SAC和染色體乘客復合物的相互作用，在第一次減數分裂過程中發揮K-MT連接錯誤修正的作用。隨著年齡的增加，SGO2的表達減少，導致著絲粒凝聚力減弱，這可能有助于PSSC的發生。
DNA損傷
卵母細胞中的基因組不穩定性可能導致染色體異常，從而導致不孕或發育障礙。因此，一些研究報告稱，來自老鼠的去卵泡卵母細胞（denuded oocytes）和卵泡復合體（COCs）中凋亡增加。來自老鼠的MII卵子的DNA碎片化程度較高，這可能是凋亡的早期指示（圖1和圖2）。有趣的是，盡管去卵泡卵母細胞中的凋亡發生率（其中去除了周圍的卵泡顆粒細胞）隨著年齡的變化沒有差異，但來自老鼠的COCs表現出更高的凋亡率。這表明，卵母細胞與周圍卵泡細胞之間的年齡相關溝通變化可能驅動凋亡。卵母細胞中DNA損傷的年齡相關增加也可能是由于DNA修復基因表達減少以及卵泡液中抗氧化物（包括褪黑激素）減少所致。此外，除非K-MT連接無誤，SAC會在減數分裂I期防止過渡到后期，在DNA損傷的情況下，SAC還會誘導卵母細胞發生減數分裂I期停滯。因此，來自老鼠的卵母細胞中SAC功能的破壞使得減數分裂得以繼續進行，盡管存在DNA損傷。關于衰老如何影響卵母細胞中的DNA損傷和修復的問題仍然存在爭議，一些研究小組報告稱，卵母細胞修復紫外線引起的損傷的能力在整個生殖衰老過程中維持在較高水平，而另一些研究則指出，卵母細胞和MII卵子中的DNA雙鏈斷裂隨年齡增加而增加。
端粒縮短
在卵母細胞中，端粒長度可能預測發育能力。卵母細胞中的端粒長度隨著年齡的增長逐漸減少，且在年輕和中年小鼠中比老年小鼠更具異質性。端粒末端沒有保護帽時的DNA損傷，被稱為端粒功能障礙誘導的焦點，隨著卵母細胞年齡的增長而增加，這表明基因組完整性的喪失。端粒酶的表達和相對活性也隨著年齡的增長而在卵母細胞中減少。作為端粒潛在調節因子的去乙酰化酶6（SIRT6）在卵母細胞中的表達隨著年齡的增長而減少。年輕小鼠卵母細胞中SIRT6的敲除導致端粒縮短，并在隨后的二細胞胚胎中增加端粒功能障礙誘導的焦點，而在老年小鼠卵母細胞中過表達SIRT6則能拯救這些胚胎表型。
表觀遺傳調控
隨著生育年齡的增加，基因組范圍的DNA甲基化水平下降，并且與DNA甲基轉移酶的表達減少相關。在老年小鼠的二次極體卵母細胞中，DNA甲基轉移酶的豐度減少，且其在細胞質與核之間的轉運也下降。盡管一些研究發現印記基因無論年齡如何均保持適當的甲基化，但也有研究報告稱，卵母細胞中母源印記基因的表達隨年齡增加而升高，表明甲基化的喪失。有趣的是，來自老年小鼠的卵母細胞中，組蛋白3在賴氨酸4（H3K4me3）和賴氨酸36（H3K36me3）的三甲基化水平減少。H3K4me3在減數分裂成熟過程中調控mRNA降解，并且與H3K4me3的減少一致，老年小鼠的卵母細胞中mRNA降解受到損害。進一步地，CxxC-finger蛋白1（CXXC1）對于H3K4me3的積累至關重要，來自卵母細胞特異性Cxxc1敲除小鼠的配子在mRNA降解上表現出類似老年小鼠卵母細胞的缺陷。此外，卵母細胞中的核糖體DNA甲基化隨年齡增加。由于DNA甲基化對于染色質重塑、基因組印記、X染色體失活及許多其他細胞活動至關重要，老年小鼠卵母細胞中的異常DNA甲基化可能導致卵子質量下降。
一些研究探討了衰老小鼠模型中配子中組蛋白4在賴氨酸5、8、12和16位點的乙酰化情況。H4K5和H4K8的乙酰化模式在不同年齡的卵母細胞中相似，但來自老年小鼠的卵母細胞中H4K12和H4K16的乙酰化水平較低。H4K12在年輕小鼠的卵母細胞中完全去乙酰化，但在老年小鼠的二次極體卵母細胞中，不論是在體內還是體外成熟的卵母細胞中，H4K12卻仍保持乙酰化狀態，這表明衰老可能打亂了調控減數分裂過程中組蛋白去乙酰化的機制。總體來看，有研究認為，異常的組蛋白去乙酰化可能導致與年齡相關的染色體非整倍體和不育。
細胞質成熟
女性配子在卵泡生成和卵母細胞成熟的最后階段積累mRNA、蛋白質和大分子，這些物質支持減數分裂成熟、受精和早期胚胎發育（補充圖4c）。衰老與細胞質成熟的改變相關（圖1）。由于成熟的卵母細胞在轉錄上處于沉默狀態，因此蛋白質翻譯的嚴格調控對減數分裂成熟至關重要，而隨著年齡的增長，翻譯效率會下降。老年小鼠的卵母細胞表現出降解酶活性減少，并且與蛋白質穩態和蛋白質代謝相關的基因表達減少，導致受損蛋白質的積累。例如，氧化損傷會減少α-微管蛋白的穩定性和聚合能力，從而破壞減數分裂紡錘體的完整性。然而，最近的研究發現，來自老年小鼠的卵母細胞并未表現出降解酶活性下降或蛋白質聚集增加。相反，這些卵母細胞以及特定的卵巢間質細胞，包含高穩定性的長壽命蛋白，這些蛋白對于維持蛋白質穩態至關重要，并參與關鍵的細胞結構，如線粒體、核糖體和細胞骨架的組裝。這些蛋白質的極高穩定性被認為是保護長壽命細胞（如女性生殖系細胞）免受損傷積累的適應性特征。因此，這些穩定蛋白質的最終喪失可能會導致卵母細胞和卵巢功能隨年齡下降。此外，來自老年小鼠的卵母細胞通常只有一個核仁，而來自年輕小鼠的卵母細胞則有多個核仁。隨著年齡增長，核仁的結構和功能會發生變化，而核仁對于核糖體和蛋白質的生產至關重要。例如，來自老年小鼠的卵母細胞中，纖維蛋白酸酯酶（fibrillarin）的表達增高，這與核糖體RNA的異常甲基化以及翻譯精度差的核糖體生產有關。與年輕小鼠相比，來自老年小鼠的卵母細胞中，溶酶體（促進蛋白質降解）和自噬體（將物質輸送到溶酶體）數量減少，表明宏自噬功能障礙。由于這一途徑對于清除受損蛋白質至關重要，因此其功能障礙可能會導致卵母細胞質量下降。來自老年小鼠的卵母細胞表現出與年齡相關的轉錄組變化。全基因組分析顯示，諸如Cdk10、Cep63和Chek2等減數分裂調控因子在老年小鼠卵母細胞成熟過程中與年輕小鼠相比呈差異性表達。有趣的是，Brca1、Brca2、Sirt1、Sgo2a和Sgk1等轉錄本在年輕和老年小鼠卵母細胞中的表達水平相似，但它們的翻譯隨著年齡的增長顯著下降。關鍵轉錄本翻譯的下調可能會導致老年小鼠卵母細胞中更高的成熟失敗和非整倍性發生率。母源mRNA的降解和清除對于減數分裂恢復和合子基因組激活是必需的，而來自老年小鼠的MII卵子中這一過程受到損害，這可能會導致胚胎發育異常。
除了上述導致蛋白質穩態喪失和宏自噬功能障礙的機制外，卵母細胞在細胞質成熟過程中還會經歷金屬穩態受損（圖2）。在卵子發生過程中，卵母細胞會積累鋅，這是減數分裂進程所必需的，因為在鋅螯合劑存在的情況下進行的體外成熟會導致卵母細胞停滯在類似減數分裂I末期的狀態。此外，在受孕前飼喂鋅缺乏飲食的小鼠表現出減數分裂成熟和受精能力的下降，著床和胎盤發育的缺陷，以及增加的妊娠喪失和胚胎發育缺陷。有趣的是，生殖衰老與卵細胞內鋅的豐度減少和分布不規則相關，這可能會損害減數分裂進程和生殖結果。
線粒體與氧化應激
如同卵巢體細胞中所見，生殖年齡與卵母細胞線粒體的結構和功能缺陷相關。在年輕小鼠中，卵母細胞的線粒體呈圓形且未分化，關于與老年小鼠卵母細胞相比線粒體嵴數目的報道存在沖突。一些研究表明，由于線粒體嵴為氧化還原反應和ATP生產提供了表面積，較少的嵴和較少的線粒體可能會導致卵母細胞在衰老過程中ATP生產減少。線粒體膜電位是線粒體活動的一個關鍵指標，并且在老年小鼠的卵母細胞中降低。此外，老年小鼠的卵母細胞中線粒體常常出現空泡化，這可能是細胞凋亡的標志。線粒體質量由線粒體未折疊蛋白反應和線粒體自噬調控。參與這些途徑的蛋白質，如HSPD1、LONP1和總PRKN，在卵母細胞中隨著年齡的增長而表達減少。
卵母細胞中線粒體的分布也隨著年齡變化。在年輕小鼠中，卵母細胞的線粒體在核膜breakdown 過程中集中在核周圍，并在減數分裂I期（MI）和減數分裂II期（MII）時圍繞染色體。相比之下，老年小鼠的卵母細胞中，線粒體主要聚集在卵質中。與老年小鼠卵母細胞相比，年輕小鼠的卵母細胞中線粒體與肌動蛋白細胞骨架的共定位更為明顯，表明這兩者之間的關聯隨著年齡的增長而喪失。事實上，當使用細胞骨架組裝抑制劑處理時，年輕小鼠的卵母細胞表現出成熟度下降、ATP生產減少，并且線粒體分布與老年小鼠的卵母細胞相似。與年齡相關的甲基乙二醛積累（這是糖酵解的反應性副產物）可能會導致線粒體定位的改變，因為當年輕小鼠的卵母細胞暴露于外源性甲基乙二醛時，線粒體無法正確定位到紡錘體上，導致減數分裂延遲或停滯。
卵母細胞中的與年齡相關的氧化應激增加了線粒體受損的易感性（圖2）。一些研究報告表明，來自老年小鼠的卵母細胞相較于年輕小鼠，具有較低的線粒體DNA（mtDNA）含量和較高的mtDNA突變率。此外，年輕小鼠的卵母細胞在成熟過程中，mtDNA含量會增加，而老年小鼠的卵母細胞則保持穩定。線粒體RNA的質量和變異不會隨年齡變化。
與年齡相關的氧化應激還會改變卵母細胞的脂質組，特別是減少幾類磷脂的豐度，可能會影響卵母細胞的質膜。脂質在高氧化應激環境中的過氧化作用會產生自由基，如羥基壬烯醛（4-HNE），并且4-HNE會在老年卵母細胞中積累。將來自年輕小鼠的卵母細胞處理4-HNE會降低卵母細胞的胚胎發育能力（PBE）、干擾紡錘體并誘導染色體非整倍體。此外，活性氧（ROS）的增加及其與一氧化氮不足的關系與卵母細胞質量下降有關。
受精與胚胎發育
受精、卵子活化和胚胎發育?? 卵子激活包括精子融合后（或孤雌激活后）啟動的一系列事件，這些事件促進了多精阻滯、卵子中減數分裂的恢復以及向胚胎發育的有絲分裂過渡（補充圖4d）。在受精時，精子可溶性因子 PLCζ 將磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸 （PIP2） 水解為甘油二酯 （DAG） 和肌醇 1,4,5-三磷酸 （IP3）。IP3 與卵內質網上的受體結合，從而觸發一系列胞質鈣 （Ca2+） 振蕩。Ca2+ 參與啟動減數分裂恢復和皮質顆粒胞吐作用 （CGE）。卵在 MII 被停滯，MII 由 M 期促進因子 （MPF） 活性維持。Ca2+ 啟動一系列磷酸化事件，導致 MPF 失活，從而觸發減數分裂恢復。MPF 活性降低會降低絲裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 的活性，這是完成減數分裂、擠出第二極體和誘導原核形成所必需的。Ca2+ 釋放還參與 CGE 的激活，以促進透明帶硬化并確保多精阻斷。在卵泡生成過程中，皮質顆粒 （CGs） 在卵母細胞中形成并遷移到皮層。響應細胞內 Ca2+ 的增加，CGs 與細胞膜融合并釋放其內容物以修飾透明帶的細胞外基質。雌性和雄性原核的融合導致染色體重排，產生二倍體受精卵 （E0.5）。1-細胞胚胎經歷有絲分裂，將細胞質分成全能卵裂球（小鼠的 E0.5-3.0），并從母體基因組激活過渡到合子基因組激活。在 8-細胞階段，胚胎經過壓實以產生桑椹胚，并發生第一次細胞譜系命運決定。第一個細胞命運決定結果是形成囊胚（小鼠中的 E3.5），它包含產生胚胎組織的多能細胞的內部細胞團 （ICM） 和 產生胚胎外組織的滋養外胚層 （TE）。
受精與卵子激活
女性生殖衰老的特點是卵子數量和質量的下降，這可能會影響受精、卵子激活和胚胎發育。隨著年齡的增長，受精率下降，部分原因是衰老小鼠每個周期排卵的卵子數量減少。盡管在某些小鼠品系中，卵巢過度刺激可產生相同總數量的排卵卵子，無論年齡如何，但衰老小鼠中卵母細胞破碎、未受精卵和低質量胚胎的發生率更高。體外受精的成功率對于年輕和老年小鼠的卵子相似，但將年輕小鼠的卵子暴露于老年小鼠的血清中，會抑制體外受精的結果，這表明與年齡相關的微環境變化可能是衰老小鼠受精率下降的一個因素。
卵子激活包括一系列分子變化——由孤雌生殖或受精引發——這些變化對于介導卵子到胚胎的轉變是必要的（補充圖4d）。鈣離子（Ca2+）的波動對于解除卵子在第二次減數分裂停滯狀態并啟動胚胎發生至關重要。在受精時，精子特異性的磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C（PLCζ）水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）為二酰甘油（DAG）和肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）。IP3與內質網上的受體結合，啟動鈣離子波動。鈣離子在配子中的動態變化具有小鼠品系特異性，但有證據表明，隨著年齡的增長，卵子中鈣離子儲存的大小和參與鈣穩態調節的基因表達會減少。高級生殖年齡還與精子引發激活后補充鈣離子儲存的能力下降，以及孤雌生殖激活后鈣波動的頻率和持續時間減少相關。總體而言，來自老年小鼠的卵子在孤雌生殖激活和發育上比來自年輕小鼠的卵子更具抗性。
與年齡相關的鈣信號變化已被與特定的信號通路聯系起來，包括蛋白激酶C（PKC）家族（圖2）。來自老年小鼠的卵母細胞表現出PKC同種型的表達減少和PKC活性降低；而在老年小鼠卵母細胞中用PKC激動劑處理也無法挽救這一表型。高水平的成熟促進因子（MPF）和有絲分裂激活蛋白激酶（MAPK）維持MII期停滯，而卵子激活過程中的鈣波動會導致MPF和MAPK活性的降低。來自生殖年齡較大的小鼠的卵子在激活后含有更高的MPF和MAPK活性，這與減數分裂恢復延遲、卵裂未能完成（PBE失敗）以及前核形成延遲相關。
胚胎發育
隨著年齡的增長，胚胎發育受到損害（圖1和圖2）。在老年小鼠體內發育的胚胎表現出細胞碎片化增加、細胞數量減少、胚外胚層標志物Cdx2表達降低以及較小的囊胚腔，這可能與較高的細胞死亡率有關。此外，來自老年小鼠的合子和二細胞胚胎表達較少的DNA損傷修復相關蛋白，這也促進了非整倍體的發生。在體外發育的胚胎在囊胚形成和與細胞分裂相關基因的表達方面也表現出類似的損傷。
老年小鼠胚胎發育不良可能與染色質的乙酰化增加有關；在年輕小鼠的胚胎樣體中誘導的染色質乙酰化導致了與老年小鼠類似的囊胚發育。此外，來自老年小鼠的胚胎表達較高水平的促炎性趨化因子CXCL5，這是一種衰老相關分泌表型（SASP）的特征。用CXCL5處理年輕小鼠的胚胎抑制了滋養層細胞的擴展，減少了著床并損害了胚胎發育，表型模仿了老年小鼠的情況。
來自老年小鼠的胚胎也表現出線粒體功能障礙。年輕和老年雌性小鼠受精卵的單細胞RNA測序分析表明，涉及離子運輸的基因發生了改變。老年小鼠胚胎的細胞內pH值增加，這部分是由于HCO3?/Cl?交換活性降低所致。改變的pH值通過降低膜電位和增加活性氧（ROS）來影響胚胎中的線粒體功能。線粒體DNA（mtDNA）是胚胎發育的決定因素，在合子基因組激活之前，必須支持早期胚胎分裂細胞中的線粒體生物生成的穩定水平。與年輕小鼠的胚胎相比，老年小鼠胚胎中的mtDNA含量波動，且基因表達不足以支持線粒體生物生成，導致能量不平衡，從而導致受精前胚胎發育失敗。此外，老年小鼠囊胚中mtDNA水平的不穩定與染色體數目異常（單倍體）相關。有趣的是，老年小鼠卵母細胞中SIRT1蛋白表達的減少也可能促成胚胎發育受損，因為卵母細胞特異性Sirt1敲除小鼠由于氧化應激增加和早期胚胎分裂紊亂而表現出早期不育。最后，老年小鼠胚胎在正常分化事件之前，CDX2和NANOG等細胞命運決定標志物的表達加速，從而導致胚胎發育失敗。
繁殖與懷孕
著床和懷孕期間的子宮動力學?? 排卵后4天囊胚到達子宮。ICM細胞進一步分化為外胚層和原始內胚層，分別產生胚外內胚層組織和胎兒組織和胚外中胚層。隨著胚胎繼續有絲分裂，它從透明帶孵化。植入是感受性囊胚和受體子宮內膜之間同步的結果，導致胚胎附著、侵襲和胎盤發育（補充圖 4e）。容受性窗口（ window of receptivity ）定義了受孕酮和雌激素調節的接受性子宮與有能力的囊胚之間的時空串擾期。子宮內膜上皮細胞和基質細胞在周期的增殖部分響應雌激素水平的升高而增殖，而黃體酮負責周期黃體期基質細胞的分化和蛻膜化。在小鼠中，胚胎植入子宮內膜隱窩。胚胎與管腔上皮接觸后，子宮內膜基質細胞發生蛻膜化。蛻膜細胞是分泌性的和瞬時的，除了支持母體血管灌注外，還可以侵入囊胚。滋養層由源自滋養外胚層的胎兒細胞組成，侵入并遷移到母體蛻膜中，并分化成各種胎盤前體。因此，胎盤是源自胎兒和母體細胞的內分泌器官，介導胎兒和母親之間的交流。胎盤具有支持懷孕和胎兒生長所需的許多功能，包括保護胎兒免受母體免疫系統的影響、營養和氧氣供應以及廢物清除。適當的胎盤發育和功能對于妊娠進展是必要的，而其改變會導致妊娠并發癥和流產。
繁殖
隨著年齡的增長，老齡小鼠的繁殖能力受損，表現為交配行為、妊娠和后代結果的紊亂（圖1）。繁殖年齡較大的雌性小鼠在與雄性配對后，受孕時間延長，陰道栓存在率降低。生育次數與年齡相互作用，影響交配行為，未曾繁殖的老年雌性小鼠需要更長的交配時間才能成功懷孕，與曾經繁殖過的老年小鼠相比。隨著年齡增長，體重增加影響繁殖結果。那些維持較低體重的衰老小鼠表現出更高的生育力和更長的壽命。隨著年齡的增長，窩重顯著減少。窩重開始在中年時下降，在多個品系中，12個月齡后完全停止活仔出生。盡管絕對的繁殖壽命因品系不同而有所差異，但觀察到的與年齡相關的窩重減少是高度穿透性的，并且與卵巢儲備的耗竭一致。然而，即使年輕小鼠和老年小鼠排卵的卵子數量相似，老年小鼠的窩重較小，這表明衰老還會損害子宮功能和胎兒發育。
子宮形態與動力學
子宮是一個內分泌響應器官，在發情周期中經歷動態的形態變化，以支持胚胎著床和妊娠。子宮由子宮內膜和子宮肌層組成，子宮內膜包括上皮和基質部分，這些部分在發情/月經周期和妊娠過程中會對激素產生反應；子宮肌層則是一個平滑肌層，在妊娠期間會擴展，在分娩時則會收縮（補充圖4e）。隨著年齡的增長，子宮的大小和重量會增加，盡管細胞增殖隨著年齡的增長而減少，但由于結締纖維的產生增多以及彈性纖維合成的失敗，子宮內膜的纖維網絡會增多（圖1）。隨著年齡的增長，子宮基質細胞也表現出DNA碎片化的增加，進而導致細胞凋亡的增加。調控營養運輸、細胞分化和基因印記的基因表達發生變化，子宮中促炎細胞因子和趨化因子的表達也隨年齡增加而升高。
在生育能力衰退的老年小鼠中，子宮表現出形態學異常，包括自發性子宮病變的發生率較高，如腺性囊性增生和子宮肌層腫瘤。子宮內膜出現萎縮，表現為薄且角化的上皮，內膜腺體擴張以及嗜酸性膠狀物質的存在。子宮肌層顯示出不典型的平滑肌形態，并伴有更多的平滑肌瘤、平滑肌肉瘤和血管化腫瘤的發生。老化的子宮基質細胞表現出DNA碎片化的增加，進而導致細胞凋亡的增加，部分原因是終止蛋白30（Tp-30）水平的升高。氧化還原失衡促進了子宮中的氧化應激，表現為促氧化酶NOX1的表達增加以及子宮內膜基質中蛋白質羰基的積累。
衰老子宮的一個主要表現是激素受體敏感性和反應性的喪失。隨著年齡的增長，子宮內雌激素和孕激素受體的水平、結合能力和激活作用發生減少，并且在激素不規律之前，中年期雌激素應答基因網絡發生改變，導致激素功能紊亂。這些激素受體動態的變化可能會影響子宮內膜的生長和對胚胎植入的敏感性。
胚胎植入和妊娠
與年輕小鼠相比，老年小鼠的胚胎植入減少，胚胎吸收增加。植入失敗的原因有多種，包括缺乏黃體激素支持、影響胚胎植入基因轉錄的表觀遺傳改變，以及蛻膜化缺陷（見圖2）。在蛻膜化過程中，子宮內膜細胞增殖并分化，以支持滋養層細胞侵入植入胚胎。來自老年小鼠的胎盤含有過多的滋養層巨細胞，這與子宮內生長受限和胎盤迷宮（即營養和氣體交換的部位）發育失敗有關。此外，衰老的子宮間質環境可能干擾正常的滋養層功能。來自老年子宮間質的條件培養基誘導分化為海綿滋養層細胞和滋養層巨細胞，并降低由Eomes、Cdx2和Esrrb編碼的滋養層自我更新標志物的表達，從而減少胎兒對胎盤的貢獻。滋養層缺陷似乎是衰老胎盤的固有特征，因為當來自老年小鼠的胚胎移植到年輕的養母小鼠子宮中時，妊娠并發癥可以得到拯救，表現為正常的植入、滋養層分化以及胎兒發育，胎兒的頂臀長度相似。
另一個與植入缺陷相關的機制是胎盤和胎兒組織中CpG島（CGIs）DNA甲基化保真性的喪失，導致CGI的高甲基化。CGI高甲基化破壞了必要的植入基因的轉錄調控，改變了母體和父源印記基因，從而導致胎兒生長受限或胎盤過度生長，并干擾啟動蛻膜化所必需的激素反應途徑。植入后基質和血管重塑在衰老過程中受到損害；老年小鼠未表現出子宮動脈壁質量增加、平滑肌層分化或細胞增殖的現象。最后，氧化應激也會影響植入。老年小鼠的胎盤中銅/鋅依賴性超氧化物歧化酶（SOD）活性增加，提示啟動了一種補償性的活性氧（ROS）清除機制。
老年小鼠的分娩并發癥，包括妊娠期延長和分娩持續時間增加（見圖1）。妊娠時間延長部分是由于晚期妊娠中孕酮水平下降的反應遲鈍所致。與年輕小鼠相比，老年小鼠的分娩時間更長，表現為頻繁但短暫的宮縮。與年齡相關的連結蛋白-43和催產素受體表達減少，損害了子宮肌層的細胞間通信，從而影響了宮縮頻率。此外，子宮平滑肌中的線粒體DNA拷貝數較低，可能會促進與年齡相關的分娩改變，因為線粒體調節平滑肌的收縮。老年小鼠還表現出生殖道的改變，包括宮頸擴張和僵硬增加，以及宮頸區域陰道的神經支配減少。總體而言，妊娠期的子宮和胎盤展示了多種與年齡相關的機制，導致不利于胎兒生長和分娩的環境。
后代結局
高母齡對后代健康產生負面影響。老年小鼠的妊娠期和出生后的胎兒死亡率較高。死產、先天性畸形和出生缺陷在老年小鼠的后代中更為普遍，包括胎兒生長受限、心臟缺陷、水腫以及大腦和神經管畸形。老年小鼠的后代往往出生體重較低。此外，由于與年齡相關的母性行為和護理變化，它們更容易被母鼠食用。因此，這可能導致后代喪失，并影響數據的解釋，除非進行嚴格的斷奶前監測。
對老年母鼠后代胚胎組織的Global轉錄組分析揭示了胎兒大腦的轉錄組異質性，伴隨著與胎兒神經發育、晶狀體誘導和觀察學習相關基因的下調。此外，與H3K4甲基化相關的基因減少顯示了高母齡對胎兒大腦的年齡依賴性表觀遺傳效應。證據表明，老年小鼠的幼崽具有較低的學習能力和整體較低的預期壽命。隨著全球越來越多女性推遲生育，關于后代結局和專注于高母齡跨代效應的綜合分析已成為活躍的研究領域。
結論與展望
生理性衰老小鼠模型揭示了年齡對生殖細胞、組織和器官的全面影響，進而損害了生育能力和生殖健康結局。女性生殖衰老與下丘腦-垂體-卵巢（HPO）軸的失調以及卵巢儲備的耗竭相關，導致每個周期排卵的卵子數量減少。卵巢基質變得纖維化和炎癥化，部分原因是氧化應激增加，這也促使組織剛度增加。在卵母細胞及其卵泡支持細胞中，線粒體功能受損、表觀遺傳調控改變、DNA損傷增加，端粒變短。衰老與卵母細胞中染色體不相等（非整倍體）增加相關，原因包括紡錘體缺陷和染色體凝聚力喪失。此外，卵母細胞的蛋白穩態隨著年齡的增長而受到干擾。這些缺陷導致卵子激活能力下降以及胚胎發育受損，這與年齡相關。母親年齡較大也與子宮形態改變和對類固醇激素的反應遲鈍有關，從而導致胎盤植入受損、胎兒數量較少和更多的不良胎兒結局。
理解衰老如何影響整個生殖軸是非常重要的，因為衰老在一個器官中擾動的過程會影響其他器官的過程。例如，在小鼠中，衰老相關的一個特征性表現是胎兒數量減少。最初，人們認為這是由于卵巢儲備耗竭和每個周期排卵卵子的數量減少所致，但這一表型顯然是多因素的。隨著年齡增長，子宮形態和功能的異常、繁殖行為的改變、早期胚胎發育受損以及著床缺陷可能都參與其中。通常，衰老對這些器官和過程的影響是單獨研究的；而通過移植和共培養模型，可以研究多層次的相互作用。例如，通過研究將年輕小鼠子宮移植到年老小鼠體內的胎兒數量，可以區分衰老在配子和子宮層面上的后果。女性生殖衰老領域仍存在顯著的研究空白；特別是衰老對乳腺、輸卵管、宮頸、陰道以及卵巢周圍脂肪組織的影響尚未得到充分表征。總體而言，我們預計該領域未來的研究將整合衰老相關擾動在生殖軸以及其他受內分泌變化影響系統中的多層次效應。
衰老相關功能衰退的機制在各個器官系統中大體是保守的。在已描述的12個衰老特征中，有11個與小鼠的女性生殖系統衰老相關（圖1和圖2）。例如，線粒體功能障礙和表觀遺傳變化與卵巢、卵母細胞、胚胎和子宮的衰老有關。這最終導致卵泡發育和配子質量下降、受精和胚胎發育不良，以及著床和胎兒發育受損。此外，與下丘腦-垂體-卵巢（HPO）軸失調相關的衰老內分泌特征會導致細胞間通訊的變化，進而產生更廣泛的系統性效應。由于女性生殖系統的衰老通常早于其他器官系統，因此該領域的研究成果可能有助于揭示全身軀體的衰老過程。除了衰老的保守特征外，我們還將基質和血管重塑以及金屬穩態失調納入了女性生殖衰老的范疇（圖1和圖2）。卵巢外基質（ECM）衰老引起的失調會導致纖維化和組織僵硬，從而影響卵泡生長、排卵以及卵巢癌等病理的發生發展。隨著年齡增長，金屬穩態的喪失會影響配子的減數分裂和發育能力。盡管我們的研究沒有揭示微生物組失衡作為衰老機制之一，但它可能在其中發揮重要作用。陰道微生物群失調是更年期的特征之一，它影響生育、妊娠和分娩；此外，它還會增加感染的易感性并損害生活質量。
盡管近年來女性生殖衰老領域受到了更多關注，但這一主題的研究自20世紀50年代以來便已開始。許多數十年前的基礎性發現已經被重新審視，借助先進的技術、工具和模型來驗證新的機制假設。采用無偏的組學方法，或者利用現有的組學數據集以及單細胞和空間轉錄組學技術，正在快速發展，并揭示了許多關于生殖器官如何隨每個生殖周期以及整個生命周期發生變化的細節。
盡管生殖衰老不是一種疾病，但它是一個重要的生物學過程，可以作為治療干預的目標，不僅有助于改善生殖健康和生育能力，還能緩解內分泌功能障礙并改善更年期后的健康。從這些新闡明的衰老機制中涌現出了一些經驗基礎的治療機會（見表2）。例如，卵巢纖維化可以通過靶向線粒體代謝和基質重塑來逆轉。通過抗纖維化藥物治療和二甲雙胍補充，可以通過減少纖維化膠原沉積、促進清除促纖維化和產生衰老相關分泌表型（SASP）纖維母細胞的免疫群體、恢復排卵能力并降低與年齡相關的炎癥基因表達，促進老鼠卵巢的組織穩態（見表2）。其他有前景的治療方法包括那些靶向與年齡相關的線粒體功能障礙以改善卵母細胞質量的方法，如NAD+補充、BGP-15治療和線粒體替代（見表2）。盡管大多數治療策略仍處于臨床前階段，但在小鼠中識別的許多生殖衰老機制在人類中也有保守性（見表3）。因此，預期具有較強的轉化潛力。
生殖衰老的影響超越了個體，因為生殖細胞是未來世代的構建基石。受孕和產前發育的環境可能會使后代更易于終生健康狀況。理解年齡對生殖系統的影響，將為改善跨代健康結果提供機會。
Balough, J.L., Dipali, S.S., Velez, K.?et al.?Hallmarks of female reproductive aging in physiologic aging mice.?Nat Aging?4, 1711–1730 (2024). https://doi.org/10.1038/s43587-024-00769-y
