寫在前面的廢話
這篇文章來自于一個舔狗的悲哀,謹以此文告訴大家莫當舔狗……
以上聊天記錄,就是整個故事背景。當時我的內心歷程:
- 我看過類似的文章欸,趕緊發出來展現一下我的閱讀量,說不定可以被夸
- 怎么回事?怎么和我想得不一樣,沒有被夸就算了,咋還安排了一個journal?
好了,廢話這么多,進入正題吧
太長不看系列
- coBATCH方法大體上與CUT&Tag使用的方法保持一致,但是略有不同
- 都具有信號高,背景噪音低的優點
廢話超多系列
ChIP-seq方法可以為我們揭示細胞的表觀組信息,但是這個方法有一些缺點,比如信號低,背景噪音高,細胞所需的起始量較高等……為了解決這些問題,單細胞ChIP-seq方法應運而生。接下來,我將比較最近的兩個單細胞ChIP-seq方法。
CUT&Tag方法
這篇文章于今年4月份由Henikoff實驗室發表,以下簡稱為CUT&Tag方法
實驗操作
下圖是該方法的具體工作流程:
- 第一步先對細胞進行透化
- 透化后的細胞使用特異性抗體結合(此抗體可以是任何我們所需要的表觀修飾的抗體)
- 加入二抗,此處加入二抗的目的是為了增加后續proteinA-Tn5結合的位點
- 加入proteinA-Tn5融合蛋白。proteinA 提供了特異性結合抗體的能力,而Tn5由于其自身的cut&paste能力,可以對目標序列片段化并加上adapter
- 加入Me2+離子,激活反應
- 對于加上adapter的序列進行PCR擴增并上機測序
方法驗證
接下來就是一系列的常規操作了,首先講一下這個方法如何的好,之前的方法如何的不好,再與之前的方法相比一下,該方法的優點在哪里……
如果時間充足,可以詳細看看此處文章是如何優缺點的,如果時間不足,建議直接跳到CoBATCH方法部分
以下講解都是圖在上,具體內容在下,謹慎食用
- 比較傳統ChIP-seq不同測序深度時的信噪比,發現50M reads有更高的信噪比,背景噪音較低。
- 比較相同測序深度的CUT&Tag方法,ChIP-seq方法以及CUT&RUN方法(另一種ChIP方法,依賴于MNase-proteinA融合蛋白,該方法需要人工加接頭)。明顯能看到CUT&Tag方法和CUT&RUN方法有更高的信噪比
- 比較CUT&Tag方法對于不同組蛋白修飾的測序結果,發現不僅是K27me3,K4me1和K4me2也具有很高的信噪比
- 文章使用一個非特異性的抗體作為陰性對照,發現信號大都很彌散,符合預期
- 此外,作者還使用了ATAC-seq技術分析染色質開放區域,發現K4me2與ATAC-seq信號區域有很高的重合率,并在后續分析中繪制Metaplot以及heatmap進一步驗證結果(此處未放圖)。最終結果表明H3K4me2對于染色質開放區域的捕獲具有很高的靈敏性。
- 除了組蛋白修飾,文章還對RNA PolⅡ進行了分析,得到了相似的結果
此處使用的是K562細胞,為了驗證該方法對于細胞類型不具有特異性,對H1 ES 細胞也進行過了上述分析,并得到了相似的結果
除了對組蛋白修飾以及RNA聚合酶Ⅱ的分析,作者還對轉錄因子的效力做了進一步驗證。
- NPAT是一個組蛋白基因復制依賴的轉錄共激活因子,結合在chr1和chr6上大約80個位點
- 作者對結合位點進行分析后發現,有一部分信號落在了基因組的開放區域。這一部分信號,作者認為很有可能是由于proteinA-Tn5非特異性結合所導致。
- 不過作者通過分析不同信號的測序深度,可以有效地將轉錄因子結合位點信號與ATAC site位點信號分離。
- 由于NPAT的結合位點較少,作者進一步分析了CTCF protein的結合位點信號,并得到了相似的結果
此處有一個比較有意思的地方,從正常的角度來看,上述所說的proteinA-Tn5的非特異性結合應該屬于一個缺點。但是,作者卻反其道而行之,認為該方法在檢測轉錄因子結合位點信號的同時,還可以檢測染色體開放區域的信號。所以說,寫作技巧和思維真的很重要啊,小伙伴們
說了這么多,那究竟如何做到單細胞程度呢?如上圖所示該方法將細胞分選到一個板子里,保證給板子里的每一個孔都只有一個細胞。這樣每個小孔里都加入攜帶有不同index的proteinA-Tn5,這樣就保證了我們后續可以將不同細胞來源的DNA片段分離。
該方法需要借助單細胞ATAC-seq的分選裝置,目前已在SMARTer system中測試過,作者認為10X的裝置也可以應用于該方法。作者將單細胞的信號累加后與bulk信號相比,發現信號分布程度基本相似。
接下來作者分析了該方法究竟能不能區分細胞的類型。首先使用Fraction of reads繪制小提琴圖,我們可以清楚的看到不同類型的細胞,其分布顯著不同。此外,作者還選取了幾個基因位點,發現利用一些特定基因位點的信號分布也可以區分細胞類型。
優缺點總結
優點 | 缺點 |
---|---|
耗時短(10h) | 需要特殊裝置進行細胞分選 |
背景噪音低 | |
信號水平高 | |
fraction of reads in peak(FRiP)高 | |
可以在細胞內原位反應 | |
檢測轉錄因子信號的同時可以檢測染色質開放區域 | proteinA-Tn5存在少量非特異性的結合 |
FRiP可以簡單的理解為特異性
CoBATCH方法
這篇文章于今年8月份由何愛彬實驗室發表,以下簡稱為CUT&Tag方法。該方法的大致流程與CUT&Tag方法相似,只是在加標簽的步驟略有不同
該方法對細胞進行了兩次分選,第一次保證板子里的每個小孔只含有200-250個細胞,此時加入proteinA-Tn5,攜帶有T5/T7標簽。在反應結束后將細胞再次分布,保證板子里的每個小孔只含有20-25個細胞。此時加入含有i5/i7的標簽。
最終,我們得到的每個細胞DNA,都含有兩個不同的index,保證細胞有不同的index組合(此處小聲逼逼,作者此處分析發現大概有7%的細胞可能有相同的index組合,并認為7%很低,我個人覺得這個比例還是蠻高的)
接下來就是和CUT&Tag文章相同的操作了,方法優劣的比較以及該方法的具體應用。因為不做單細胞,所以對于其應用中的具體操作就不在這里介紹了。
方法比較
對上述兩種方法做一個簡單的比較,個人見解,歡迎大家指正:
CUT&Tag | CoBATCH |
---|---|
一抗孵育一次,二孵育一次 | 只用抗體孵育了一次 |
分選一次 | 分選兩次 |
每個小孔中只有一個細胞 | 第一次分選:小孔中有200-250個細胞;第二次分選:20-25個細胞 |
沒有index重合 | index重合率為7% |
需要借助特殊裝置分選細胞 | 文章未聲明,也許不需要使得實驗操作更加平民化 |
總之,要想更準確,推薦第一種方法;要想操作簡便,推薦第二種方法
一點題外話
大家或多或少都會使用R進行數據分析,而其中的bioconductor又是我們躲不掉的阻礙。因此想在這里問問大家,是否愿意從頭開始學bioconductor,而不僅僅是簡單的對代碼復制粘貼。比如,GRanges對象,biomaRt的使用等……
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