寫在前面的廢話

這篇文章來自于一個舔狗的悲哀，謹以此文告訴大家莫當舔狗……

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以上聊天記錄，就是整個故事背景。當時我的內心歷程：

1. 我看過類似的文章欸，趕緊發出來展現一下我的閱讀量，說不定可以被夸
2. 怎么回事？怎么和我想得不一樣，沒有被夸就算了，咋還安排了一個journal？

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好了，廢話這么多，進入正題吧

太長不看系列

• coBATCH方法大體上與CUT&Tag使用的方法保持一致，但是略有不同
• 都具有信號高，背景噪音低的優點

廢話超多系列

ChIP-seq方法可以為我們揭示細胞的表觀組信息，但是這個方法有一些缺點，比如信號低，背景噪音高，細胞所需的起始量較高等……為了解決這些問題，單細胞ChIP-seq方法應運而生。接下來，我將比較最近的兩個單細胞ChIP-seq方法。

CUT&Tag方法

這篇文章于今年4月份由Henikoff實驗室發表，以下簡稱為CUT&Tag方法

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實驗操作

下圖是該方法的具體工作流程：

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1. 第一步先對細胞進行透化
2. 透化后的細胞使用特異性抗體結合（此抗體可以是任何我們所需要的表觀修飾的抗體）
3. 加入二抗，此處加入二抗的目的是為了增加后續proteinA-Tn5結合的位點
4. 加入proteinA-Tn5融合蛋白。proteinA 提供了特異性結合抗體的能力，而Tn5由于其自身的cut&paste能力，可以對目標序列片段化并加上adapter
5. 加入Me2+離子，激活反應
6. 對于加上adapter的序列進行PCR擴增并上機測序

方法驗證

接下來就是一系列的常規操作了，首先講一下這個方法如何的好，之前的方法如何的不好，再與之前的方法相比一下，該方法的優點在哪里……

如果時間充足，可以詳細看看此處文章是如何優缺點的，如果時間不足，建議直接跳到CoBATCH方法部分
以下講解都是圖在上，具體內容在下，謹慎食用

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1. 比較傳統ChIP-seq不同測序深度時的信噪比，發現50M reads有更高的信噪比，背景噪音較低。
2. 比較相同測序深度的CUT&Tag方法，ChIP-seq方法以及CUT&RUN方法（另一種ChIP方法，依賴于MNase-proteinA融合蛋白，該方法需要人工加接頭）。明顯能看到CUT&Tag方法和CUT&RUN方法有更高的信噪比
3. 比較CUT&Tag方法對于不同組蛋白修飾的測序結果，發現不僅是K27me3，K4me1和K4me2也具有很高的信噪比
4. 文章使用一個非特異性的抗體作為陰性對照，發現信號大都很彌散，符合預期
5. 此外，作者還使用了ATAC-seq技術分析染色質開放區域，發現K4me2與ATAC-seq信號區域有很高的重合率，并在后續分析中繪制Metaplot以及heatmap進一步驗證結果(此處未放圖)。最終結果表明H3K4me2對于染色質開放區域的捕獲具有很高的靈敏性。
6. 除了組蛋白修飾，文章還對RNA PolⅡ進行了分析，得到了相似的結果

此處使用的是K562細胞，為了驗證該方法對于細胞類型不具有特異性，對H1 ES 細胞也進行過了上述分析，并得到了相似的結果

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除了對組蛋白修飾以及RNA聚合酶Ⅱ的分析，作者還對轉錄因子的效力做了進一步驗證。

1. NPAT是一個組蛋白基因復制依賴的轉錄共激活因子，結合在chr1和chr6上大約80個位點
2. 作者對結合位點進行分析后發現，有一部分信號落在了基因組的開放區域。這一部分信號，作者認為很有可能是由于proteinA-Tn5非特異性結合所導致。
3. 不過作者通過分析不同信號的測序深度，可以有效地將轉錄因子結合位點信號與ATAC site位點信號分離。
4. 由于NPAT的結合位點較少，作者進一步分析了CTCF protein的結合位點信號，并得到了相似的結果

此處有一個比較有意思的地方，從正常的角度來看，上述所說的proteinA-Tn5的非特異性結合應該屬于一個缺點。但是，作者卻反其道而行之，認為該方法在檢測轉錄因子結合位點信號的同時，還可以檢測染色體開放區域的信號。所以說，寫作技巧和思維真的很重要啊，小伙伴們

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說了這么多，那究竟如何做到單細胞程度呢？如上圖所示該方法將細胞分選到一個板子里，保證給板子里的每一個孔都只有一個細胞。這樣每個小孔里都加入攜帶有不同index的proteinA-Tn5，這樣就保證了我們后續可以將不同細胞來源的DNA片段分離。

該方法需要借助單細胞ATAC-seq的分選裝置，目前已在SMARTer system中測試過，作者認為10X的裝置也可以應用于該方法。作者將單細胞的信號累加后與bulk信號相比，發現信號分布程度基本相似。

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接下來作者分析了該方法究竟能不能區分細胞的類型。首先使用Fraction of reads繪制小提琴圖，我們可以清楚的看到不同類型的細胞，其分布顯著不同。此外，作者還選取了幾個基因位點，發現利用一些特定基因位點的信號分布也可以區分細胞類型。

優缺點總結

FRiP可以簡單的理解為特異性

CoBATCH方法

這篇文章于今年8月份由何愛彬實驗室發表，以下簡稱為CUT&Tag方法。該方法的大致流程與CUT&Tag方法相似，只是在加標簽的步驟略有不同

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該方法對細胞進行了兩次分選，第一次保證板子里的每個小孔只含有200-250個細胞，此時加入proteinA-Tn5，攜帶有T5/T7標簽。在反應結束后將細胞再次分布，保證板子里的每個小孔只含有20-25個細胞。此時加入含有i5/i7的標簽。

最終，我們得到的每個細胞DNA，都含有兩個不同的index，保證細胞有不同的index組合（此處小聲逼逼，作者此處分析發現大概有7%的細胞可能有相同的index組合，并認為7%很低，我個人覺得這個比例還是蠻高的）

接下來就是和CUT&Tag文章相同的操作了，方法優劣的比較以及該方法的具體應用。因為不做單細胞，所以對于其應用中的具體操作就不在這里介紹了。

方法比較

對上述兩種方法做一個簡單的比較，個人見解，歡迎大家指正：

總之，要想更準確，推薦第一種方法；要想操作簡便，推薦第二種方法

一點題外話

大家或多或少都會使用R進行數據分析，而其中的bioconductor又是我們躲不掉的阻礙。因此想在這里問問大家，是否愿意從頭開始學bioconductor，而不僅僅是簡單的對代碼復制粘貼。比如，GRanges對象，biomaRt的使用等……

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