摘要：

rna結合蛋白SRSF3(也稱為SRp20)在調控pre-mRNA剪接中起著關鍵作用。srsf3的合子敲除導致胚泡階段的胚胎阻滯。然而，SRSF3也存在于卵母細胞中，提示它可能是一種重要的母系遺傳因子。在這里，我們確定SRSF3作為小鼠卵母細胞中可變剪接和轉座元件的必要調節因子，以維持轉錄組的完整性。通過三維延時共聚焦實時成像，我們發現srsf3在發育完全的生發小泡（GV）卵母細胞中有條件的缺失極大地削弱了生發小泡破裂(GVBD)的能力，從而進入減數分裂。通過結合單細胞RNA-seq和卵母細胞的空間阻斷反義寡核苷酸和RNAse-H誘導gapmers的微操作，我們發現突變卵母細胞中GVBD的缺陷是由于異常的可變剪接和B2 SINE轉座元件的去抑制?？傊?，我們的研究強調了如何通過rna結合蛋白SRSF3控制母體轉錄組的轉錄身份對受精卵母細胞的發育至關重要。

介紹：

受精能力強的卵母細胞的發育包括完成減數分裂、細胞質成熟事件(為受精和胚胎發生提供能力)以及通過保護免受反轉錄轉座子激活等干擾因素的影響而維持基因組完整性1。這些重要的過程在很大程度上依賴于mRNA和蛋白質，它們在卵母細胞生長階段(2、3)作為母體遺傳因子合成并儲存在卵母細胞中。具有完整生發囊泡(GV)的生長卵母細胞在其生長階段結束時的前期I(稱為完全生長的GV卵母細胞)被阻滯。在黃體生成素的誘導下，完全生長的GV卵母細胞會經歷生發囊破裂(GVBD)并恢復減數分裂。減數分裂I開始于減數分裂紡錘體的組裝，當卵母細胞擠出第一個極體時完成。當卵母細胞在減數分裂II中期(稱為MII卵母細胞)被阻滯時，減數分裂成熟完成2。由于生長中的GV卵母細胞從轉錄活躍狀態過渡到完全生長的GV和MII卵母細胞的轉錄不活躍狀態4，因此有必要在保持卵母細胞轉錄組完整性的同時，產生足夠的母體轉錄本庫。

影響轉錄組復雜性的最重要因素之一是pre-mRNA可變剪接(AS)5,6。小鼠基因組中絕大多數蛋白質編碼基因(89%集合版本82)發生AS。通過AS正確組合外顯子可確保表達特定環境所需的基因同種型。 AS 可導致具有不同功能的替代蛋白質亞型的表達 7，而剪接控制的缺陷可導致功能喪失，在多能細胞、發育和疾病模型中觀察到嚴重的表型8,9。 小鼠和人類MII卵母細胞中保守的階段特異性轉錄變體的存在 10-13 表明剪接控制在母體轉錄組的調節和建立中起著核心作用。 然而，影響卵母細胞 AS 和轉錄組完整性調節的因素在很大程度上仍是未知的。

富絲氨酸/精氨酸(Serine/arginine-rich, SR)剪接因子3 (SRSF3或SRp20)是一種rna結合蛋白，屬于一個高度保守的絲氨酸/精氨酸(Serine/arginine, SR)蛋白家族14。與SR蛋白家族的其他成員一樣，SRSF3是AS的剪接因子和調節因子，但它也參與許多其他轉錄后過程，包括RNA聚腺苷化21,RNA輸出22,pre-miRNA加工23，以及內部核糖體進入位點介導的病毒RNA24翻譯。SRSF3對著床前胚胎發育至關重要25，然而，其對母體轉錄組的貢獻尚未見報道。在這里，我們發現小鼠卵母細胞中SRSF3功能的喪失嚴重損害了母體轉錄組，極大地損害了進入減數分裂的能力。通過分析SRsF3突變體完全生長的GV卵母細胞的單細胞RNA-Seq數據，我們確定了普遍剪接畸變，這部分解釋了觀察到的表型。令人驚訝的是，SRSF3缺失還引起了轉錄組組成的劇烈變化，其特征是突變卵母細胞中B2(SINE)逆轉錄轉座子的表達增加。我們的研究強調了通過rna結合蛋白對母體轉錄組的精確控制對受精卵細胞的生長和發育是多么重要。

結果：

母系SRSF3蛋白的缺失導致發育在一個/兩個細胞階段停滯

盡管Srsf3合子敲除胚胎在囊胚階段之前死亡，但卵母細胞衍生的 SRSF3 在卵母細胞中的作用尚不清楚。我們首先使用免疫熒光（IF）和單細胞定量 PCR 評估了 SRSF3蛋白和 mRNA 是否存在于卵母細胞和植入前胚胎中（圖 1a，b）。我們的結果表明 Srsf3 在 GV 和 MII 卵母細胞中高表達（在減數分裂 II 的中期），因此它是一種母體因素。因為SRSF3存在于卵母細胞中，傳統的合子敲除(Srsf3-/-)胚胎將在早期胚胎發生期間具有這種母系遺傳的蛋白質。因此，我們使用Zp3-Cre交配策略建立了母體 Srsf3 敲除卵母細胞（稱為 Zp3-Cre+，S r s f 3f/f），這導致所有雌性配子的功能喪失（補充圖 S1a）26。 IF分析證實突變卵母細胞中不存在 SRSF3（補充圖 S1b）。五只母體敲除雌性與野生型雄性交配，但沒有一個產生活后代（數據未顯示）。

為了確定不孕的可能原因，我們檢查了從與野生型雄性交配的突變體Zp3-Cre+、Srsf3f/雌性中收集的母體敲除胚胎的發育（補充圖 S1c）。 從五個有栓子的交配Zp3-Cre+、Srsf3f/雌性小鼠中，我們只從一只小鼠身上獲得了受精胚胎。 此外，在體外培養過程中，突變胚胎在單細胞或雙細胞階段停滯（補充圖S1d），并且根據 IF 判斷，它們都缺乏 SRSF3 蛋白（補充圖 S1e）。 總之，這些結果表明母體 SRSF3 對于植入前胚胎發育至關重要。

srsf3敲除的卵母細胞表現出嚴重的GVBD缺陷

為了確定母細胞敲除胚胎在卵母細胞中SRSF3耗盡后早期停止的原因，我們進行了3D慢速共聚焦實時成像，并在體外減數分裂成熟過程中用EB3-eGFP和H2B-RFP顯示微管和DNA。為了控制完全生長的GV卵母細胞，我們發現GVBD之后，紡錘體組裝轉移到卵母細胞表面，一組染色體分離到第一極體。隨后，第二個紡錘體組裝，卵子在中期II期(稱為MII卵母細胞)被阻滯(Supplementary Movie S1, Fig.1c)。在突變卵母細胞中，我們觀察到兩種相互排斥的表型。第一個表型以GVBD缺失為特征(Supplementary Movie S2, Fig.1d)，我們在所有突變卵母細胞中檢測到66.7% (16 / 24)GVBD (Fig.1e)。第二種表型見于 33.3% 的突變卵母細胞 (8/24)，表現為延遲的 GVBD 和減數分裂紡錘體最終崩潰(Supplementary Movie S3, fig 1c - e)。這兩種表型似乎是由突變卵母細胞中GVBD的缺陷引起的。

GVBD的主要調節因子是成熟促進因子 (MPF)，這是一種由 CDK1 (CDC2) 和調節亞基細胞周期蛋白 B127 組成的復合物。為了研究在突變卵母細胞中觀察到的GVBD缺陷是否與 MPF 活性的失調有關，我們使用 FRET 生物傳感器進行了 F?rster 共振能量轉移 (FRET) 實驗，檢測細胞周期蛋白 B1-CDK1 激酶磷酸化，從而檢測對照和突變完全生長的 GV 卵母細胞中的激酶 在體外成熟期間（圖 1f）。在所有對照卵母細胞中，我們發現了類似的CyclinB1-CDK1活性模式，其中 CDK1 在 GVBD 之前不久被激活。 隨后，CDK1 活性逐漸降低，然后在極體擠出時再次達到峰值（圖 1h）。 相比之下，突變卵母細胞表現出可變波動的 CDK1 活性，并且在 GVBD 之前沒有觀察到 CDK1 的主要激活峰（圖 1g）。這些結果表明，在突變卵母細胞中觀察到的GVBD缺陷可能是由減數分裂進入的上游中斷引起的，而不是由GVBD所涉及的事件引起的。

卵母細胞中SRSF3敲除導致AS發生許多變化

為了研究GVBD缺陷的分子機制，我們對對照和突變卵母細胞進行了單細胞rna測序。對照和突變樣本與小鼠卵母細胞公開的RNA-Seq數據聚在一起，并與其他著入期胚胎分開29(圖2a)。當我們比較突變體和對照表達譜時，我們發現它們形成兩個不同的組（圖2b）。 有趣的是，與對照卵母細胞相比，突變卵母細胞的基因表達譜顯示出更高的變異，這可能反映了與對照卵母細胞中觀察到的嚴格進展相比，突變卵母細胞表型的更高變異，即使沒有明確的亞群可區分（圖 2b）。我們發現3190個基因（1440 個下調基因和 1750 個上調基因）在突變體和對照之間的轉錄水平上顯示出顯著（超過 2 倍）的差異（補充表 S2）。 盡管如此，我們發現大多數減數分裂相關基因的轉錄水平沒有顯著變化，包括MPF基因 Cdk1、Ccnb(cyclin B1)27、促進因子 Cdc25b30、Marf11、Plk131、Plk432、Bub1b33、Emi134 和 Securin35，或抑制因子 Ppp33b、Gpp2c Wee237、Pkmyt138、Kdm1a39、Cdh1、Fzr140、41 和 Cdc14b42（圖 2c）。

由于SRSF3是AS的重要調控因子，我們想知道SRSF3耗盡是否會導致剪接模式的改變。為了檢測新的AS事件，我們統計了所有的分裂reads(映射到基因組中兩個不同部分的reads，“候選剪接事件”)。然后我們計算每個可變剪切event讀取計數的折疊變化。由于我們感興趣的是相對于同一基因的所有其他連接使用的變化，我們分別計算了每個基因的差異剪接，從而糾正了基因表達的整體變化。我們的結果顯示，與對照組相比，突變卵母細胞中未注釋的剪接事件增多(突變卵母細胞中為51%，對照組為32%)(圖3a)，這表明AS在srsf3突變卵母細胞中受到強烈影響，導致出現大量未在任何環境中描述的亞型。雖然這些以前未注釋的事件中有些可能是真正的規范AS事件，但也可能有一個子集對應于“異?！笔录@些事件在任何野生類型上下文中都不會以高頻率發生。這些事件可能改變基因亞型的編碼序列，從而可能改變蛋白質功能，在某些情況下導致非功能性基因亞型(Supplementary Table S3)。該分析還證實了突變卵母細胞外顯子跳過事件的富集(圖3b)。我們共同發現SRSF3對于維持剪接完整性至關重要，最常見的是通過促進野生型小鼠卵母細胞的外顯子包含。

為了直接闡明srsf3調節的剪接活性與RNA結合之間的關系，我們分析了已發表的胚胎癌細胞交聯和免疫沉淀(CLIP)實驗數據44。在對照和突變卵母細胞中，利用SRSF3調節的盒外顯子上的SRSF3 CLIP結合數據集生成SRSF3調節的剪接map45。我們發現，與SRSF3沉默的外顯子(藍色痕跡)或不受SRSF3調控的控制跳過外顯子(灰色痕跡)相比，SRSF3增強的替代外顯子也被稱為突變特異性跳過外顯子(補充圖S2，紅色痕跡)中的SRSF3結合水平升高。在增強的外顯子兩側的長內含子區段中，結合沒有升高(補充圖S2，紅色痕跡)。SRSF3在其側翼組成外顯子、其直接內含子側翼以及與SRSF3沉默的備選外顯子相關的所有區域的結合也沒有明顯升高(補充圖S2，藍色痕跡)。這些結果表明，SRSF3直接與SRSF3增強的盒外顯子結合，并促進了成熟轉錄本中外顯子的包含。（這個圖沒看懂）

在srsf3敲除卵母細胞中brd8和pdlim7 as調控不當導致GVBD缺陷

作為研究個體錯誤調節的AS事件對 GVBD 表型的貢獻的起點，我們有選擇地驗證了一些預測在對照和突變卵母細胞中受 SRSF3 調節的外顯子跳躍事件，重點關注具有與GVBD表型相關的功能的基因：Brd8（溴結構域 8）、Pdlim7（PDZ 和 LIM 結構域 7）和 Npm2（核質蛋白 2）。 BRD8含有結合乙?；嚢彼岬匿褰Y構域，并參與組蛋白乙酰轉移酶活性、染色質重塑和轉錄的調節，pdlim7基因合子敲除小鼠可導致出生后致死。 NPM2 被稱為卵母細胞衍生因子，對核仁組織和早期胚胎發育至關重要。

我們對照和突變卵母細胞進行了RT-PCR，利用引物在這些基因跳過的外顯子兩側(補充表S1)，并測定了外顯子跳過的百分比。我們的結果證實了brd8的第11外顯子的跳躍性增加(圖。3c, d)，npm2的外顯子2和3(補充圖S3a, S3b)和從使用pdlim7外顯子5到外顯子6的互斥開關(補充圖S3c, S3d)。brd8和pdlim7的AS事件均在Ensembl中注釋，并保持相同的閱讀框架，而Npm2的外顯子跳躍事件在本研究中是新發現的，并預測通過幀移位導致無義介導的mRNA衰減(NMD)。綜上所述，這些結果表明，SRSF3在促進外顯子包含以確保功能蛋白正確剪接和翻譯方面具有關鍵作用。

接下來，我們研究了人工誘導AS是否可以再現突變卵母細胞中的GVBD缺陷。我們設計了反義寡核苷酸(ASOs)50靶向假設的SRSF3結合位點44，誘導brd8外顯子11、Pdlim7外顯子5、npm2外顯子2和外顯子3的特異性跳躍事件(圖4a，補充圖S4a，補充表S1)。然后我們將這些 ASOs 顯微注射并將 ASOs 混入小鼠野生型卵母細胞的細胞質和細胞核中，并對單次注射的卵母細胞進行 RT-PCR，引物位于跳過的外顯子兩側（圖 4b）。我們的結果表明，將ASO顯微注射到小鼠野生型卵母細胞中將所有三個 AS 事件轉換為在 Srsf3 突變卵母細胞中觀察到的剪接模式（圖 4b-d，補充圖 S4b-c）。接下來，我們允許注射 ASO 的卵母細胞進入減數分裂，并通過微管蛋白、微管標記物和 DAPI 的免疫染色檢查 ASO 誘導的外顯子跳躍對 GVBD 的影響，以可視化染色體（圖4e，f，補充圖 S4d）。我們發現ASO介導的 Brd8 和 Pdlim7?AS的變化導致這些注射的野生型卵母細胞的 GVBD 部分失?。▓D4g）。相比之下，ASO介導的 Npm2 外顯子跳躍幾乎不影響GVBD（補充圖 S4e）。這些結果表明SRSF3介導的Brd8和Pdlim7外顯子包含對于維持小鼠卵母細胞減數分裂中適當的GVBD是必不可少的。

Srsf3敲除卵母細胞顯示 B2 SINE 逆轉錄轉座子的去抑制

接下來，我們調查了我們的觀察結果，即與對照樣本相比，突變卵母細胞中可分配到基因的RNA-Seq reads的數量更少，這表明轉錄組的總體組成發生了顯著改變。令人驚訝的是，這種差異很大程度上可以解釋為重復元素的上調(圖5a)。特別的是，我們發現SINEs，一種高度重復的反轉錄轉座子，被系統地上調(圖5b)。SINE逆轉錄元件無處不在，位于從基因間區域到嵌入蛋白質編碼基因的整個宿主基因組中 51, 52，但通常像在對照卵母細胞中一樣被抑制以防止不良后果 51。SINE元件的顯著上調表明逆轉錄轉座子可能對 Srsf3 基因敲除小鼠中觀察到的 GVBD 缺陷有貢獻，因此我們進一步研究了這種 SINE 上調。

在所有的SINE家族中，來自B2_Mm1a、B2_Mm1t和B2_Mm2的元素在上調的元素集合中明顯過多(p< 1e?16,Fig.5c)。使用唯一映射的讀數，我們確定了數千個元素，這些元素在三個SINE家族中的每一個的突變卵母細胞中的表達增加（補充表S4，圖 5d）。 與此類SINE元件重疊的基因在突變細胞中表現出更高的表達，但與 SINE 表達的上調相比，差異要小得多（補充圖 S5a-c）。為了更好地理解生成的轉錄本，我們首先對齊表達的元素，然后將RNA-Seq讀數映射到對齊的元素（圖 5e）。 我們的分析沒有顯示顯著的剪接模式，表明生成的 RNA 主要由轉錄的 SINE 元件組成（圖 5e）。

為了檢驗表達的SINE元件是否與非表達元件有不同的特性，我們調查了它們在注釋基因中的分布。我們觀察到在B2_Mm1a和B2_Mm1t家族的內含子中富集突變特異性元件，在這三個家族的外顯子中富集元件(圖5f)。這種外顯子富集在B2_Mm2家族中尤其強烈(圖5f)。當我們研究與上調的SINE元件重疊的外顯子時，我們發現它們在3 '端（最后一個外顯子處）顯著富集(Fig.5g, j)。此外，表達元件更多地位于與重疊基因相同的一條鏈上(Fig.5h-j)。通過單細胞定量PCR，我們證實了B2 SINE元件上調了srsf3敲除卵母細胞(補充圖S5d)。B2 SINE元件在合子野生型16-C胚胎中也高表達，而在合子敲除的16-C胚胎中表達不受影響(補充圖s5e)。這表明SRSF3在卵母細胞中具有特異性抑制SINE基因表達的作用。

為了研究SRSF3如何調節B2 SINE的表達，我們檢測了小鼠ES細胞和生殖細胞中抑制不同類型逆轉錄轉座子的表觀遺傳修飾物的表達53。這些修飾因子在調控DNA甲基化/去甲基化、組蛋白甲基化、miRNA生物發生或piRNA通路等方面發揮重要作用。雖然大多數逆轉錄轉座子抑制子的轉錄水平沒有顯著差異，但我們發現，與對照組相比，突變卵母細胞Piwil1(也稱為Piwi或Miwi)下調了2倍(補充圖S5f, S5g)，提示SRSF3缺失時異常的piRNA通路活性可能導致B2 SINE上調。另一方面，利用在線工具(RBPmap) (http://rbpmap.technion.ac.il/)69)，我們在表達的B2 SINE元件中發現了幾個潛在的SRSF3結合位點(補充圖S5h)。此外，我們分析了已發表的胚胎癌細胞CLIP實驗數據44，發現SRSF3確實可以直接與B2 SINE元件結合(Supplementary Figure S5i)，這表明SRSF3與B2 SINE rna直接結合的缺失也可能導致突變表型。綜上所述，我們的分析確定了卵母細胞轉錄組對SRSF3缺失的響應發生了顯著變化，特異性地誘導了一個子集的SINE反轉錄轉座子的表達。

上調B2 SINE表達有助于srsf3敲除卵母細胞中GVBD的缺陷

為了檢測B2 SINE上調是否與GVBD缺陷有關，我們研究了在突變卵母細胞中上調的B2 SINE表達是否可以挽救GVBD缺陷。反義“gapmer”寡核苷酸直接rna - h裂解靶rna被用于降低B2 SINE RNAs54的表達。因此，我們設計了4個gapmers針對上調B2 SINE共識序列的不同部分(Supplementary Table S1)。為了研究這些gapmers對B2 SINE rna表達的影響，我們將這些聚集的gapmers微注射到對照和突變體完全生長的GV卵母細胞中，并在體外培養24小時后使用單細胞定量PCR檢測B2 SINE rna的表達(圖6a)。與未注射gapmers的突變卵母細胞相比，注射gapmers的突變卵母細胞B2 SINE rna表達顯著下調(圖6b)。引人注目的是，我們發現注射了B2 SINE gapmers的突變卵母細胞經歷了類似于對照卵母細胞的 GVBD，而對照卵母細胞注射了 B2 SINE gapmers（圖 6c，d）。 這些結果表明，減少上調的 B2 SINE RNA 確實可以挽救突變卵母細胞中的 GVBD 缺陷。

在小鼠marf1缺失的卵母細胞中，逆轉錄轉座子的上調與核雙鏈斷裂(DSBs)的增加和GVBD缺陷有關1。然而，我們發現對照卵母細胞和突變卵母細胞之間的dsb數量沒有顯著差異(Supplementary Figure S6a-b)，提示上調B2 SINE可能不會通過增加dsb而導致GVBD缺陷。為了研究在小鼠野生型卵母細胞中過表達B2 SINE rna是否直接導致GVBD缺陷，我們利用B2 SINE基因的一致序列體外轉錄合成了rna。然后我們將B2 rna微注射到野生型完全生長的GV卵母細胞中，并測量注射卵母細胞發生GVBD的百分比(圖6e)。我們發現，與水注射的卵母細胞相比，注射B2 SINE rna的卵母細胞的GVBD百分比顯著減少(減少40%)(圖6f, g)。這些結果表明，在突變卵母細胞中，上調B2 SINE rna有助于挽救GVBD缺陷。我們的研究強調了對母體轉錄組完整性的精確控制對于促進卵母細胞減數分裂和早期胚胎發育是多么重要。

討論

母細胞遺傳因子對受精能力強的卵母細胞發育和胚胎發生至關重要。然而，目前還不清楚如何控制母體轉錄組的建立，以及關鍵的調節因子是什么。許多證據表明，替代的pre - mrna剪接和加工對母體轉錄組的形成有重要貢獻10,12。在這里，我們報道了rna結合蛋白SRSF3是有助于母體轉錄組精確建立和調控的關鍵因素。SRSF3缺失最顯著的可觀察表型是GVBD的缺陷，導致srsf3母系敲除小鼠不育(圖1)。對照卵母細胞和SRSF3敲除卵母細胞的單細胞RNA-Seq分析(圖2)顯示，SRSF3不僅通過其在AS調控中的預期作用塑造卵母細胞轉錄組(圖3，補充圖S6c)，而且在小鼠卵母細胞中抑制轉座因子表達(圖5，補充圖S6c)。

SRSF3耗盡對AS的一個顯著后果是，兩個注釋的盒外顯子(如brd8和pdlim7)以及以前未被觀察到被跳過的外顯子(如Npm2)的跳過增加(圖3)。此外，將我們的RNA-Seq數據與已發表的SRSF3 iCLIP數據44進行整合，發現SRSF3在這些外顯子內的結合達到峰值(補充圖S3e)，這與SRSF3作為剪接激活子的傳統作用一致，剪接增強子與剪接增強子結合。最近研究表明，SRSF3與核m6A“reader”蛋白YTHDC155共同調節一些選擇性剪接的外顯子。在小鼠卵母細胞中，SRSF3是否參與了內標組和AS之間類似的功能交互仍是一個有趣的可能性。

依賴srsf3的AS事件包括可能與GVBD表型相關的基因內的外顯子。值得注意的是，盡管許多AS事件都受到SRSF3缺失的影響，但我們能夠部分復制GVBD缺陷，使用外顯子靶向ASOs誘導pdlim7或brd8基因的單個剪接事件的改變(圖4)。這些AS事件的選擇是由于基因與GVBD的功能關聯。然而，AS事件對蛋白質亞型功能的確切影響尚不清楚。brd8外顯子11的跳躍性維持了閱讀框，與mRNA序列從17外顯子到19外顯子編碼的溴域距離較遠。在pdlim7外顯子5和6的選擇之間切換也維持了閱讀框，直接影響編碼蛋白在PDZ結構域的c端和c端LIM結構域的上游。雖然外顯子5編碼插入的長度相當長(40個氨基酸比6個氨基酸)，但在srsf3敲除后誘導的外顯子6亞型編碼一個功能未知的PFAM結構域(DUF4749)56，該結構域可能調節PDZ結構域的肌動蛋白結合功能。相比之下，npm2外顯子2和外顯子3的跳過被清楚地預測會通過幀移導致NMD而導致功能喪失，但這一事件的操縱對GVBD沒有影響(補充圖S4)。

令人驚訝的是，卵母細胞中SRSF3的缺失也極大地改變了轉錄組的組成，B2 SINE逆轉錄轉座子的表達顯著且一致地激增(圖5)。在人類細胞中，由于內含子Alu元素的“外顯”，當hnRNPC被敲低時，表達的Alu序列被上調57。Alu元素含有類似于真性剪接位點的序列，但這些序列通常被hnRNPC阻斷。相比之下，上調B2 SINES insrsf3敲除的卵母細胞是自主轉錄的(圖5)。值得注意的是，在野生型卵母細胞中，B2 SINEs的實驗過表達足以誘導GVBD的缺陷(圖6e, f)，表明轉錄組的多種變化有助于觀察到的srsf3敲除了卵母細胞的表型。與剪接相比，SRSF3 的直接作用很可能（圖 4h），導致 B2 SINE 誘導和 GVBD 后續缺陷的機制不明顯，但可能是由 SRSF3 的間接或直接作用引起的。 上調可能是由 PIWI 相互作用 RNA（piRNA）途徑的成分下調引起的間接影響，例如 Piwil1（補充圖 S5e，f），導致 B2 SINE 反轉錄轉座子的沉默或降解喪失。 我們沒有檢測到 Piwil1 的剪接改變，這可能是通過 SRSF3 的直接剪接效應導致其下調的原因。 然而，這可能與我們的單細胞 RNA-Seq 數據中缺乏序列深度有關，特別是如果新的外顯子跳躍事件導致 NMD。 在這種情況下，B2 SINE 上調將是破壞 SRSF3 作為剪接因子的常規功能的下游結果。

另一方面，也可能存在直接作用，因為B2 SINE共識序列包含預測的SRSF3結合位點，對已發表的SRSF3 CLIP數據的生物信息學分析表明，SRSF3與B2 SINE直接結合(Supplementary Figure S5G-I)。這種直接作用意味著SRSF3的結合導致B2 SINE rna的降解，這將是SRSF3的一種新功能。B2 SINE與SRSF3的結合也可能解釋了注射B2 SINE RNA誘導GVBD表型的能力。由于SRSF3的可用水平較低，注射RNA對SRSF3的隔離可能導致靶AS事件的錯誤調控，這一過程類似于as RNA結合蛋白被CUG擴展RNA隔離所導致的剪接錯誤調控。

除了眾所周知的剪接調節因子，SRSF3還在RNA聚腺苷化21、RNA輸出22、pri-miRNA加工23和翻譯中發揮轉錄特異性作用24。仍然有可能，這些過程中的一些調控不當也可能導致GVBD表型。然而，通過操縱SRSF3調控的單個AS事件來部分重現GVBD表型的能力與SRSF3的主要功能被破壞是一致的。

計算和實驗的局限性給確定卵母細胞的分子機制帶來了挑戰，因為可能的實驗分析僅限于那些為單個細胞開發的。計算上，研究B2元素的主要挑戰之一是其短而高重復的DNA序列。盡管可以識別出大量的活性位點，但它們并不總能被區分出來，因此，相對于基因表達的估計，單個元件的表達估計更不確定。我們的分析表明，相對于現有基因而言，表達的B2 SINE元件與未表達的元件是不同的(圖5)，然而，高度的不確定性使得對周圍基因表達的任何關聯產生準確的生物信息學預測具有挑戰性。雖然通過內源性小干擾RNA或piRNAs52抑制反轉錄轉座子的研究為DNA甲基化、組蛋白修飾和序列特異性RNA降解的作用提供了一些見解，但關于這種強烈誘導B2 SINE在卵母細胞表達的研究實例尚不清楚。盡管其機制尚不清楚，但我們的發現為通過上下文特異性RNA結合蛋白調控逆轉錄轉座子開啟了令人興奮的新可能性。

綜上所述，我們報道了在敲除srsf3后，小鼠卵母細胞的轉錄組組成出現了高度可重復、普遍的變化，以及數百個剪接異構體的失調。我們的研究強調了AS和逆轉錄轉座子表達在維持細胞功能中的相關性，并提示SRSF3在小鼠卵母細胞轉錄完整性的建立和控制中發揮了重要作用。